Bedeutung von Protein-Protein Interaktionen von Tegument-Proteinen des humanen Cytomegalovirus für die Virusreplikation und den Zelltropismus
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das humane Cytomegalovirus (HCMV) ist ein wesentlicher Krankheitserreger, besonders im Rahmen der Transplantationsmedizin. Die Viruspartikel enthalten eine für Herpesviren charakteristische, als Tegument bezeichnete Proteinschicht, deren Proteinbestandteile mehrere Proteinkomplexe bilden, wie in der ersten Förderperiode gezeigt wurde. Die für Betaherpesviren spezifischen Bestandteile ppUL35 und pUL24 wurden näher untersucht. Das koterminale Proteinpaar ppUL35/ppUL35a hat wichtige Funktionen beim Start der Infektion sowie beim Partikelzusammenbau. Eine Reihe zellulärer Interaktionspartner wurden identifiziert und bestätigt, darunter Gene, die signalabhängige Wachstums- und Zelltod-Entscheidungen beeinflussen (z.B. CIAPIN). Durch Pentapeptid-Scanning-Mutagenese wurde eine Region auf dem langen ppUL35 definiert, die mit CIAPIN interagiert. Die Übertragung dieser Mutationen in den Kontext des viralen Genoms sowie die Mutation des UL35-Startkodons ermöglichen nun die funktionells Analyse von ppUL35 und seiner Interaktion mit CIAPIN im Kontext der viralen Infektion. Während des Partikelzusammenbaus ist das kurze ppUL35a notwendig für die nukleocytoplasmatische Transkolation von ppUL82. Wir konnten nun zeigen, dass zumindest in Fibroblasten und Endothelzellen zusätzlich zu ppUL35a die Aktivität von Cyclin-abhängigen Kinasen wichtig ist. Sowohl ppUL35a als auch ppUL82 wandern zwischen Kern und Zytoplasma, wie wir in Heterokaryon-Experimenten zeigen konnten. Bioinformatisch definierte Kernexport- und Kernlokalisationssignale wurden durch Mutagenese untersucht, müssen aber noch eindeutig charakterisiert werden. Die Mutagenese von benachbarten Phosphorylierungsstellen (u.a. für CDK) zeigte, dass in Gegenwart von ppUL35a sowohl Kernimport als auch Kernexport durch Phosphorylierung beeinflusst wird. Mit fluoreszierenden Viren konnte nukleozytoplasmatische Translokation mit Methoden des High Content Screening gemessen werden, so dass nun inhibitorische Einflüsse untersucht werden können. Die aus einer UL24-Deletionsmutante erhaltenen Hinweise auf eine wichtige Funktion beim Tropismus in Endothelzellen wurde durch Punktmutationen von Startkodons sowie durch retrovirale Komplementation eindeutig nachgewiesen. Im Gegensatz zu der Deletionsmutante, deren Partikel kein pUL25 enthielten, zeigten die Viren mit Punktmutation eine normale Zusammensetzung der Virionen. Auch für den Endotheltropismus wichtige Glykoproteine zeigten in infizierten Fibroblasten ihre normale Lokalisation und wurden unverändert in Partikel aufgenommen. Aufgrund struktureller Probleme (u.a. Verzögerungen beim Umbau) sowie aufgrund der Tatsache, dass sich die untersuchten Prozesse (insbesondere die nukleozytoplasmatische Translokation von ppUL82) als komplexer herausstellten als angenommen, konnten die bearbeiteten Kernthemen noch nicht zur Publikation gebracht werden. Die Eignung fluoreszierender Viren für zellbiologische Analysen und antivirales Screening wurde in zwei Publikationen dargestellt.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2006) HCMV-induced reduction of extracellular matrix proteins in vascular smooth muscle cell cultures: a pathomechanism in vasculopathies? J. Gen. Virol., 87, 2849-2858
Reinhardt B, Winkler M, Schaarschmidt P, Pretsch R, Lüske A, Vaida B, Schmid?Kotsas A, Michel D, Walther P, Bachem M, Mertens T
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(2008) Fluorescence-based antiviral assay for the evaluation of compounds against vaccinia virus, varicella zoster virus and human cytomegalovirus. J Virol Methods, 151, 66?73
Dal Pozzo F, Andrei G, Daelemans D, Winkler M, Piette J, De Clercq E, Snoeck R
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(2010) Human Cytomegaloviruses Expressing Yellow Fluorescent Fusion Proteins - Characterization and Use in Antiviral Screening. PLoS ONE, 5, e9174
Straschewski S, Warmer M, Frascaroli G, Hohenberg H, Mertens T, Winkler M
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(2010): The Nucleotide Oligomerization Binding Domain-Like Receptor NLRC5 is Involved in IFN-Dependent Antiviral Immune Responses. J. Immunol., 184, 1990-2000
Kuenzel S, Till A, Winkler M, Häsler R, Lipinski S, Jung S, Grötzinger J, Fickenscher H, Schreiber S, Rosenstiel P
