Aufklärung der Membraninsertionsmechanismen selbstinsertierender Membranproteine mithilfe von Ensemble- und Einzelmolekülspektroskopie

• Antragsteller: Professor Dr. Sandro Keller; Professor Dr. Michael Schlierf
• Fachliche Zuordnung: Biophysik ; Biochemie
• Förderung: Förderung von 2015 bis 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 276454827

Dieser Gemeinschaftsantrag widmet sich der grundlegenden Frage, wie gewisse Membranproteine sich ohne Hilfe des Translokons oder externer Energiequellen in Lipiddoppelschichten einlagern können. Dazu beabsichtigen wir, ein umfassendes Repertoire an optisch-spektroskopischen Ensemblemethoden mit Einzelmolekül-Förster-Resonanzenergietransfer-Messungen zu kombinieren, um die strukturelle Dynamik der gefalteten und entfalteten Zustände sowie die Membraninsertionsmechanismen zweier selbstinsertierender Proteine zu untersuchen. Beim ersten Protein handelt es sich um das Helixbündel Mistic, das für die bakterielle Biofilmbildung essenziell ist. Obwohl Mistic für die Verbesserung der Produktion und Membraninsertion anderer Membranproteine genutzt wird, bleibt seine Fähigkeit zur Selbstinsertion unverstanden. Wir werden Membraneigenschaften wie die hydrophobe Dicke und das Dipolpotential erkunden, die die Faltung und Stabilität von Mistic zu modulieren scheinen, und die umgebungsabhängige Dynamik des gefalteten Zustandes sowie den Mechanismus der Membraninsertion aufklären. Wir erwarten, dadurch ein besseres Verständnis sowohl der mutmaßlichen physiologischen Funktion von Mistic als Membransensor zur Auslösung der Biofilmbildung als auch seines biotechnologischen Einsatzes als Membraninsertionschaperon zu erlangen. Beim zweiten zu untersuchenden Protein handelt es sich um die bakterielle Außenmembran-Phospholipase A (OmpLA), die sich als äußerst wertvoll für Faltungsstudien an integralen Membranproteinen erwiesen hat. Angesichts der Bedeutung dieses Proteins als Modellsystem für in-vitro-Untersuchungen beabsichtigen wir, ein besseres Verständnis des entfalteten Zustandes unter denaturierenden Bedingungen und der (gekoppelten?) Faltung und Membraninsertion zu bekommen, wobei der Rolle der Vorstrukturierung oder konformationellen Selektion besonderes Gewicht zukommt. Die Kombination dieser beiden strukturell und funktionell unterschiedlichen Membranproteine begründet sich in methodischem Synergismus und Komplementarität. Das vorliegende Gemeinschaftsprojekt hängt entscheidend von einer engen Zusammenarbeit der Gruppen der beiden Antragsteller ab, da es ein weites Spektrum an verschiedenartigen, aber komplementären Methoden und Ansätzen umfasst, darunter die Herstellung, Reinigung und ortspezifische Doppelmarkierung von Proteinen für Einzelmolekülmessungen, automatische Zirkulardichroismus-Spektroskopie und Fluoreszenzlöschung im Ensemble, Einzelmolekülexperimente mittels eines speziell dafür gebauten Instruments sowie die Entwicklung und Validierung computergestützter Analysemethoden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen