Struktur, Funktion und Evolution von Typ II Restriktionsenzymen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im Rahmen des Projekts konnten Strukturvorstellungen zu drei Restriktionsenzymen auf der Grundlage bioinformatorischer und biochemischer Daten gewonnen werden: SsoII, PspGI und MboI. Für SsoII und PspGI wurden diese mittlerweile durch Kristallstrukturanalysen bestätigt. Damit konnte eindeutiger als bisher auf eine divergente Evolution dieser Enzyme geschlossen werden. Restriktionsenzyme müssen ihre Erkennungssequenzen auf der doppelsträngigen DNA im großen Überschuss unspezifischer Sequenzen „finden“. Dies geschieht besonders effizient, da sich Restriktionsenzyme dafür nicht nur Diffusion durch den Raum (3D) sondern auch Diffusion entlang der DNA (1D) zu Nutze machen. Das haben wir im Rahmen des Projekts durch Einzelmolekülstudien direkt sichtbar machen können. Fast alle Restriktionsenzyme benötigen Magnesiumionen als essentiellen Cofaktor für die Spaltung der DNA. Es ist aber unklar, ob ein oder zwei Magnesiumionen dafür gebraucht werden; diese Problematik besteht auch bei anderen Nukleasen. Durch eine sehr detaillierte Messung des zeitlichen Ablaufs der DNA‐Spaltung in Abhängigkeit von der Magnesiumionenkonzentration konnte im Rahmen des Projekts wahrscheinlich gemacht werden, dass die Bindung von ein oder zwei Metallionen (z.B. im Kristall) nicht notwendigerweise nahelegt, dass zwei Metallionen für die Katalyse gebraucht werden, sondern dass vielmehr ein katalytisch relevantes Metallion im Zuge der Katalyse seine Position und Funktion verändert. Gene targeting und Gentherapie verlangen nach Werkzeugen, mit denen man DNA an vorbestimmten singulären Stellen spalten kann. Dazu müssen spezifische Enzyme wie die Restriktionsenzyme noch spezifischer gemacht werden. Im Rahmen des Projekts wurden sogenannte tripelhelixbindende Oligonukleotide an Restriktionsenzyme anfusioniert, um deren Spezifität zu erhöhen. In diesem Zusammenhang wurde auch versucht, Restriktionsenzyme durch Licht „schaltbar“ zu machen, d.h. sie aus einem inaktiven Zustand heraus durch einen Lichtpuls zu aktivieren, oder gar sie in reversibler Weise zu aktivieren und wieder zu inaktivieren. Das ist gelungen und könnte für gene targeting und Gentherapie von Bedeutung werden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Identification of base‐specific contacts in protein‐DNA complexes by photocrosslinking and mass spectrometry: a case study using the restriction endonuclease Ssoll. Mol Biosyst. 2005 Jul;1(2):135‐41
Pingoud V, Geyer H, Geyer R, Kubareva E, Bujnicki JM, Pingoud A
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Specificity changes in the evolution of type II restriction endonucleases: a biochemical and bioinformatic analysis of restriction enzymes that recognize unrelated sequences. J Biol Chem. 2005 Feb 11;280(6):4289‐98
Pingoud V, Sudina A, Geyer H, Bujnicki JM, Lurz R, Lüder G, Morgan R, Kubareva E, Pingoud A
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Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. Cell Mol Life Sci. 2005 Mar;62(6):685‐707
Pingoud A, Fuxreiter M, Pingoud V, Wende W
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Sliding and jumping of single EcoRV restriction enzymes on non‐cognate DNA. Nucleic Acids Res. 2008 Jul;36(12):4118‐27
Bonnet I, Biebricher A, Porté PL, Loverdo C, Bénichou O, Voituriez R, Escudé C, Wende W, Pingoud A, Desbiolles P
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On the divalent metal ion dependence of DNA cleavage by restriction endonucleases of the EcoRI family. J Mol Biol. 2009 Oct 16;393(1):140‐60
Pingoud V, Wende W, Friedhoff P, Reuter M, Alves J, Jeltsch A, Mones L, Fuxreiter M, Pingoud A
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Controlling the enzymatic activity of a restriction enzyme by light. Proc Natl Acad Sci USA. 2010 Jan 26;107(4):1361‐6
Schierling B, Noël AJ, Wende W, Hien le T, Volkov E, Kubareva E, Oretskaya T, Kokkinidis M, Römpp A, Spengler B, Pingoud A
