Rolle von HCN1- und HCN2-Kanälen in nozizeptiven Neuronen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Ziel des Projektes war die Untersuchung der Rolle von Hyperpolarisations-aktivierten und zyklischen Nukleotid-gesteuerten Kationenkanälen (HCN) in noizieptiven Neuronen der Maus. Wir konnten zu Anfang durch verschiedene molekularbiologische Analysen zeigen, dass in kleinen nozizeptiven DRG- Neuronen die prädominant exprimierte HCN-Isoform eindeutig HCN2 ist und haben uns deshalb auf die Rolle dieses Subtyps konzentriert. Die mit Hilfe des Cre/loxP-Systems durchgeführte selektive Deletion von HCN2 in nozizeptiven Neuronen war erfolgreich, wie mit qRT-PCR, Western Blot und immunhistochemischen Untersuchungen gezeigt werden konnte. Die basale Schmerzreaktion der Mutanten war unverändert, hingegen waren die Schmerzantworten bei Neuropathie deutlich reduziert. In dem im Antrag vorgesehenen Zymosan-Entzündungsmodell waren keine Unterschiede zwischen Mutanten und Kontrollen festzustellen. Hingegen zeigte sich im dann eingesetzten CFA-Entzündungsmodell, dass die auftretende mechanische Hypersensitivität durch das Fehlen von HCN2 deutlich vermindert wurde. Bei Wildtypen war dieser Effekt durch die Verabreichung des unselektiven HCN-Blockers ZD7288 auslösbar, während bei Mutanten keine Wirkung der Substanz mehr festzustellen war. Dies belegt, dass der analgetische Effekt der Substanz auf der Blockade von HCN2 in nozizeptiven Neuronen beruht. Einzelfaser-Ableitungen von isolierten entzündeten Haut-Nerven-Präparaten ergaben eine signifikant verminderte Entladungsaktivität bei HCN2-Mutanten nach mechanischer Stimulation im Vergleich zum Wildtyp. Durch einen Regionen-spezifischen pharmakologischen Kanalblock konnten wir weiterhin feststellen, dass die HCN-vermittelte mechanische Sensibilisierung sich nicht nur in peripheren, sondern auch spinalen Terminalen des DRG-Neurons abspielt. Durch funktionelle kernspintomographische Untersuchungen konnten wir zeigen, dass die Mutanten tatsächlich weniger nozizeptiven Input zu diversen supraspinalen schmerzverarbeitenden Strukturen generieren. Bemerkenswerterweise blieb die bei Entzündung auftretende Hyperalgesie auf Hitzereize durch die Nozizeptor-spezifische Deletion von HCN2 unbeeinflusst. Daraufhin haben wir in einer neuen konditionellen Mausmutante HCN2 in Nozizeptoren und im ZNS ausgeschaltet. Diese Tiere zeigten nun eine verminderte Antwort sowohl auf mechanische als auch Hitzereize unter inflammatorischen Bedingungen. Die Daten lassen vermuten, dass die thermische Hyperalgesie bei Entzündung durch neuronale HCN2-Kanäle vermittelt wird, die nachgeschaltet zu Nozizeptoren exprimiert werden. Insgesamt konnten wir also zeigen, dass HCN2 eine wichtige Rolle sowohl bei der peripheren als auch zentralen Schmerzsensibilisierung spielt. Damit stellt dieser Ionenkanal ein interessantes neues Target in der Therapie von neuropathisch und entzündlich bedingten Schmerzen dar. Welche genauen molekularen Mechanismen der HCN2-vermittelten Sensibilisierung zugrunde liegen – erhöhte cAMP-Spiegel oder eine Hochregulation und potentielle Phosphorylierung – sollen zukünftige Untersuchungen zeigen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2009) Phenotyping sensory nerve endings in vitro in the mouse. Nat Protoc 4(2):174-96
Zimmermann K, Hein A, Hager U, Kaczmarek JS, Turnquist BP, Clapham DE, Reeh PW
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(2010) The general anesthetic propofol excites nociceptors by activating TRPV1 and TRPA1 rather than GABAA receptors. J Biol Chem 285:34781-92
Fischer MJ, Leffler A, Niedermirtl F, Kistner K, Eberhardt M, Reeh PW, Nau C
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(2011) TRPA1 and substance P mediate colitis in mice. Gastroenterology 141:1346-58
Engel MA, Leffler A, Niedermirtl F, Babes A, Zimmermann K, Filipović MR, Izydorczyk I, Eberhardt M, Kichko TI, Mueller-Tribbensee SM, Khalil M, Siklosi N, Nau C, Ivanović-Burmazović I, Neuhuber WL, Becker C, Neurath MF, Reeh PW
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(2012) Methylglyoxal activates nociceptors through transient receptor potential channel A1 (TRPA1): a possible mechanism of metabolic neuropathies. J Biol Chem 287(34):28291-306
Eberhardt MJ, Filipovic MR, Leffler A, de la Roche J, Kistner K, Fischer MJ, Fleming T, Zimmermann K, Ivanovic- Burmazovic I, Nawroth PP, Bierhaus A, Reeh PW, Sauer SK
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(2012) Methylglyoxal modification of Nav1.8 facilitates nociceptive neuron firing and causes hyperalgesia in diabetic neuropathy. Nat Med 18:926-933
Bierhaus A, Fleming T, Stoyanov S, Leffler A, Babes A, Neacsu C, Sauer SK, Eberhardt M, Schnölzer M, Lasitschka F, Neuhuber WL, Kichko TI, Konrade I, Elvert R, Mier W, Pirags V, Lukic IK, Morcos M, Dehmer T, Rabbani N, Thornalley PJ, Edelstein D, Nau C, Forbes J, Humpert PM, Schwaninger M, Ziegler D, Stern DM, Cooper ME, Haberkorn U, Brownlee M, Reeh PW, Nawroth PP
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(2013) Amplified cold transduction in native nociceptors by M-channel inhibition. J Neurosci 33(42):16627-41
Vetter I, Hein A, Sattler S, Hessler S, Touska F, Bressan E, Parra A, Hager U, Leffler A, Boukalova S, Nissen M, Lewis RJ, Belmonte C, Alzheimer C, Huth T, Vlachova V, Reeh PW, Zimmermann K
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(2013) Beyond H2S and NO interplay: hydrogen sulfide and nitroprusside react directly to give nitroxyl (HNO). A new pharmacological source of HNO. J Med Chem 56(4):1499-508
Filipovic MR, Eberhardt M, Prokopovic V, Mijuskovic A, Orescanin-Dusic Z, Reeh P, Ivanovic-Burmazovic I
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(2013) The molecular basis for species-specific activation of human TRPA1 protein by protons involves poorly conserved residues within transmembrane domains 5 and 6. J Biol Chem 288(28):20280-92
de la Roche J, Eberhardt MJ, Klinger AB, Stanslowsky N, Wegner F, Koppert W, Reeh PW, Lampert A, Fischer MJ, Leffler A
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(2014) H2S and NO cooperatively regulate vascular tone by activating a neuroendocrine HNO-TRPA1-CGRP signalling pathway. Nat Commun 5:4381
Eberhardt M, Dux M, Namer B, Miljkovic J, Cordasic N, Will C, Kichko TI, de la Roche J, Fischer M, Suárez SA, Bikiel D, Dorsch K, Leffler A, Babes A, Lampert A, Lennerz JK, Jacobi J, Martí MA, Doctorovich F, Högestätt ED, Zygmunt PM, Ivanovic-Burmazovic I, Messlinger K, Reeh P, Filipovic MR
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(2014) HCN2 channels account for mechanical (but not heat) hyperalgesia during long-standing inflammation. Pain 155(6):1079-90
Schnorr S, Eberhardt M, Kistner K, Rajab H, Käßer J, Hess A, Reeh P, Ludwig A, Herrmann S
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(2015) HCN Channels – Modulators of Cardiac and Neuronal Excitability. Int J Mol Sci 16: 1429-1447
Herrmann S, Schnorr S, Ludwig A
