HPLC / ESI-Q-TOF-Massenspektrometer

• Fachliche Zuordnung: Biologische Chemie und Lebensmittelchemie
• Förderung: Förderung in 2008
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 71677780

• Erstellungsjahr: 2012

Zusammenfassung der Projektergebnisse

Der Arbeitskreis Heckel stellt modifizierte DNA und RNA her, deren Aktivität mittels Licht reguliert werden kann. Derartige Derivate können z.B. für die Regulation von Genexpression, die Modulation von Proteinaktivität oder für molekulare Diagnostik eingesetzt werden. Für die Herstellung dieser Derivate im Nanomolmaßstab ist die Analytik mittels LC-ESI-MS die zentrale Methode der Charakterisierung und das gilt noch in größerem Maße für die Analyse der Produkte der Photoreaktion. In den vergangenen drei Jahren konnten neue lichtaktivierbare DNA- und RNA-Derivate zur wellenlängenselektiven und Zwei-Photonen-Photoaktivierung entwickelt werden, sowie lichtaktivierbare Molecular Beacons. Es konnten Methoden zur lichtgesteuerten Interaktion von DNA-Nanoarchitekturen entwickelt werden, sowie lichtaktivierbare und –inaktivierbare Aptamere. Aber nicht nur für die Analytik von modifizierter DNA und RNA, sondern auch für die Charakterisierung der hergestellten Bausteine für deren Festphasensynthese, sowie für die Charakterisierung von hergestellten lichtaktivierbaren „kleinen Molekülen“ wurde das beschaffte LC-ESI-MS mit Möglichkeit zur Hochauflösungs-Massenspektroskopie (HR-MS) verwendet. So wurde z.B. eine lichtaktivierbare Variante von GlcN6P für die lichtgesteuerte Genregulation entwickelt und lichtaktivierbare Varianten von Glutathion entwickelt für die lichtgesteuerte Anordnung von Proteinen. Im Arbeitskreis Schubert-Zsilavecz werden neue Liganden für nukleäre Rezeptoren entwickelt. Im Fokus stehen dabei neben dem Farnesoid X Rezeptor (FXR) auch die Peroxisomen Proliferator-Aktivierten Rezeptoren (PPARs). Neben der in-vitro-pharmakologischen Charakterisierung der Substanzen sind vor allem Bioverfügbarkeitsuntersuchungen eine integraler Bestandteil der präklinischen Arzneistoffentwicklung. Die LC-MS-Techniken ermöglichen es nicht nur die Verfügbarkeit im Plasma zu bestimmen, sondern bieten die Möglichkeit die Konzentration direkt in den Zielgeweben der Wirkstoffe zu ermitteln. Ein weiteres Arbeitsgebiet des Arbeitskreises Schubert-Zsilavecz ist die Analytik von Naturstoffen im Hinblick auf die Bioverfügbarkeit wirksamkeitsbestimmender Inhaltsstoffe ausgewählter Phyto-pharmaka. In diesem Kontext konnte in den letzten Jahren interessante Erkenntnis zur ZNS-Verfügbarkeit der Ginkgo biloba Inhaltsstoffe Ginkolid A, B und C sowie Bilobalid gewonnen werden. Der Arbeitskreis Göbel beschäftigt sich mit der Herstellung von DNA-, RNA- und PNA-Konjugaten mit organischen Kationen wie Amidinium- oder Guanidiniumgruppen. Derartige Verbindungen sind in der Lage, DNA und RNA sequenzspezifisch zu spalten und können so als programmierbare Restriktionsendo-nucleasen verwendet werden. Für derartige Konjugate ist die Massenspektroskopie die entscheidende Analytik, da nur sehr geringe Substanzmengen hergestellt werden. Im Arbeitskreis Engels werden DNA und RNA Oligonukleotide hergestellt, die modifizierte Nukleoside beinhalten. Hier werden drei verschiedene Bereiche beforscht. Für die Diagnostik von RNA/DNA ist dies die Markierung mit Fluorophoren und Spin-Labeln. Im Vordergrund steht die „on column“ Markierung, die eine hocheffiziente Methode darstellt. Zur Analyse der gelungenen Derivatisierung ist die LC-ESI-MS zentral, besonders auch zur Methodenentwicklung. Dies gilt auch bei der Analyse von siRNAs, die mit kationisch Gruppen in der 2´-Position derivatisiert sind. Hier kann die LC-ESI-MS sehr genau die Qualität und Einheitlichkeit dieser für die Therapie wichtigen Moleküle bestimmen. In einigen Fällen haben wir auch die Methode der Hochauflösung (HR-MS) zur exakten Bestimmung der Masse genutzt.

Projektbezogene Publikationen (Auswahl)

• A large-scale chemical modification screen identifies design rules to generate siRNAs with high activity, high stability and low toxicity. Nucleic Acids Res. 2009, 37, 2867-2881
  J. B. Bramsen, M. B. Laursen, A. F. Nielsen, T. B. Hansen, C. Bus, N. Langkjær, B. R. Babu, T. Højland, M. Abramov, A. V. Aerschot, D. Odadzic, R. Smicius, J. Haas, C. Andree, J. Barman, M. Wenska, P. Srivastava, C. Zhou, D. Honcharenko, S. Hess, E. Müller, G. V. Bobkov, S. N. Mikhailov, E. Fava, T. F. Meyer, J. Chattopadhyaya, M. Zerial, J. W. Engels, P. Herdewijn, J. Wengel, J. Kjems
  
• Identification and Characterization of A Highly Efficient Anti-HIV Pol Hammerhead Ribozyme. Oligonucleotides 2009, 19, 265-271.
  T. Müller-Kuller, G. Capalbo, C. Klebba, J. W. Engels, S. A. Klein
  
• 2-(1-Ethynylpyrene)-adenosine as a folding probe for RNA-pyrene in or out. ChemBioChem 2010, 11, 664-672
  U. Foerster, K. Lommel, D. Sauter, C. Gruenewald, J. W. Engels, J. Wachtveitl
  
• 2-C-Methyluridine modified hammerhead ribozyme against the estrogen receptor. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2010, 20, 2806-2808.
  R. Pontiggia, O. Pontiggia, M. Simian, J. M. Montserrat, J. W. Engels, A. M. Iribarren
  
• A screen of chemical modifications identifies position-specific modification by UNA to most potently reduce siRNA off-target effects. Nucleic Acids Res.. 2010, 38, 5761-5773.
  J. B. Bramsen, M. M. Pakula, T. B. Hansen, C. Bus, N. Kangkjaer, D. Odadzic, R. Smicius, S. L. Wengel, J. Chattopadahyaya, J. W. Engels, P. Herdewijn, J. Wengel, J. Kjems
  
• Chemical synthesis of 2'-O-alkylated siRNAs. in: RNA Interference. From Biology to Clinical Applications. Methods in Molecular Biology 2010, 623, 155-170.
  J. W. Engels, D. Odadzic, R. Smicius, J. Haas
  
• Fluorescent Labeling of (Oligo)Nucleotides by a New Fluoride Cleavable Linker Capable of Versatile Attachment Modes. Bioconjugate Chem. 2010, 21, 1043-1055
  D. C. Knapp, J. D'Onofrio, J. W. Engels
  
• PELDOR Spectroscopy Reveals Preorganization of the Neomycin-Responsive Riboswitch Tertiary Structure. J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 1454-1455
  I. Krstic, O. Frolow, D. Sezer, B. Endeward, J. E. Weigand, B. Suess, J. W. Engels, T. Prisner
  
• Ultrafast Dynamics of 1-Ethynylpyrene-Modified RNA: A Photophysical Probe of Intercalation. J. Phys. Chem. B 2010, 114, 11638-11645
  U. Foerster, C. Gruenewald, J. W. Engels, J. Wachtveitl
  
• A light-trigger for DNA-nanotechnology. Small 2011, 15, 2163-2167
  T. L. Schmidt, M. B. Koeppel, J. Thevarpadam, D. P. N. Gonçalves, A. Heckel
  
• A light-trigger for DNA-nanotechnology. Small 2011, 15, 2163-2167
  T. L. Schmidt, M. B. Koeppel, J. Thevarpadam, D. P. N. Gonçalves, A. Heckel
  
• Comparison of the duplex destabilizing effects of nucleobase-caged oligonucleotides. Anal. Bioanal. Chem. 2011, 399, 471-477
  A. Rodrigues-Correia, M. B. Koeppel, F. Schäfer, K. B. Joshi, T. Mack, A. Heckel
  
• Construction of a structurally defined double-stranded DNA catenane. Nano Lett. 2011, 11, 1739-1742
  T. L. Schmidt, A. Heckel
  
• Coumarin caged dG for improved wavelenght-selective uncaging of DNA Org. Lett. 2011, 13, 4620-4623
  C. Menge, A. Heckel
  
• Fluoride-Cleavable, Fluorescently Labelled Reversible Terminators: Synthesis and Use in Primer Extension. Chem. Eur. J. 2011, 17, 2903-2915
  D. C. Knapp, S. Serva, J. D´Onofrio, A. Keller, A. Lubys, A. Kurg, M. Remm, J. W. Engels
  
• Long-Range Distance Measurement on Nucleic Acids in Cells by Pulsed EPR Spectroscopy. Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 5070-5074
  I. Krstic, R. Hänsel, O. Romainczyk, J. W. Engels, V. Dötsch, T. F. Prisner
  
• The Bowen–Conradi syndrome protein Nep1 (Emg1) has a dual role in eukaryotic ribosome biogenesis, as an essential assembly factor and in the methylation of Ψ1191 in yeast 18S rRNA. Nucleic Acids Res. 2011, 39, 1526-1537
  B. Meyer, J. P. Wurm, P. Kötter, M. S. Leisegang, V. Schilling, M. Buchhaupt, M. Held, U. Bahr, M. Karas, A. Heckel, M. T. Bohnsack, J. Wöhnert, K. D. Entian
  
• The RNA-DNA hybrid structure determined by EPR, CD and RNase H1. Mol. Biosyst. The RNA-DNA hybrid structure determined by EPR, CD and RNase H1. Mol. Biosyst. 2011, 7, 1050-1052, 7, 1050-1052
  O. Romainczyk, B. Endeward, T. F. Prisner, J. W. Engels
  
• Wavelengh-selective uncaging of dA and dC residues. Org. Lett. 2011, 13, 1450-1453
  F. Schäfer, K. B. Joshi, M. A. H. Fichte, T. Mack, J. Wachtveitl, A. Heckel
  
• Synthesis of 2′-O-guanidinopropyl-modified nucleoside phosphoramidites and their incorporation into siRNAs targeting hepatitis. Bioorg. Med, Chem. 2012, 20, 1594-1606
  J. Brzezinska, J. D’Onofrio, M. C. R. Buff, J. Hean, A. Ely, M. Marimani, P. Arbuthnot, J. W. Engels