Laser-Mikrodissektionssystem
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im Rahmen des SFB 599 werden die Biokompatibilität verschiedener Implantate sowie deren Wechselwirkungen mit den umgebenden zellulären Strukturen in vitro und in vivo charakterisiert. Die Materialzusammensetzung der Implantate ist ebenso vielfältig wie deren Anwendungsmöglichkeiten. Im Teilprojekt D2 werden die Adhäsion und Wachstum von Zellen auf Elektrodenoberflächen der Cochleaimplantate (Biofunktionalisierung) sowie chemisch funktionalisierte Elektrodenoberflächen in vitro und in vivo untersucht. Die Charakterisierung der Biokompatibilität und der Bioaktivität im Grenzbereich zwischen Implantat und umgebendem Gewebe erfolgt unter anderem molekularbiologisch (Genexpressions- und Proteinexpressionsanalysen). So verschiedenartig die Fragestellungen und die zu untersuchenden Gewebetypen sind, allen Projekten ist gemeinsam, daß die Analyse der Genexpressionsmuster homogene und kontaminationsfreie Gewebe- und Zellpräparationen erfordert. Diese können nur bedingt durch mikroskopgestützte, manuelle Dissektionstechniken gewährleistet werden. Die „laser microdissection pressure catapulting“-Technologie stellt ein hochspezifisches, elektronisch steuerbares, berührungsfreies und schonendes, d.h. ohne Materialverlust durch Hitzeeinwirkung, Dissektionssystem auf Laserbasis dar. Die Stärke der Lasermikrodissektionssysteme zeigt sich speziell bei Problemen der Isolation von Zellen und Zellkompartmenten in Geweben mit hoher Zelldiversität und eingeschränkter manueller Zugänglichkeit. Ebenso können einzelne Zellen oder Zellgruppen aus der Zellkultur heraus dissektiert und katapultiert werden, um z.B. rekombinante Zelllinien wie NIH3T3-Fibroblasten mit erheblich geringerem Aufwand zu rekultivieren und Bystanderzellen aus einer Primärzellkultur zu entfernen. Im Rahmen des EU-Projekts NanoEar wurde ein Genexpressionsprofiling verschiedener NTR neurotropher Faktoren, ihrer Rezeptoren (BDNF, GDNF, GFRα1, trkB, p75 ) sowie wichtiger pround anti-apoptotischer Signalmoleküle (Caspasen 3 und 9, Bcl2, Bax) in Ratten 7, 14 und 28 Tage nach Ertaubung (neomycin-induzierte Degeneration des Hörnerven) zum besseren Verständnis des molekularen Gleichgewichts zwischen Überleben der Spiralganglienzellen, den Soma des Hörnerven, und deren Apoptose nach Ototrauma durchgeführt. In Zusammenarbeit mit der Klinik für Neuroimmunologie und Neurochemie, Prof. Dr. med. Stangel, wurden mittels LMPC und real time-PCR Genexpressionsanalyse von Wachstumsfaktoren während der frühen Remyelinisierung im Corpus callosum und cerebralen Cortex nach cuprizoninduzierter Demyelinisierung durchgeführt. Desweiteren wurde die Rolle von Matrix-Metalloproteinasen in Remyelinisierungs- und Reparaturprozessen der grauen und weißen Substanz des zentralen Nervensystems untersucht. Desweiteren werden mittels LMPC Einzelzelldissektionen von Myocyten für Mutationsanalysen durchgeführt. Hinsichtlich der Applikation der LMPC-Technik zur Isolation von Zellen sowie Gewebekompartimenten aus Paraffin- und Kryoschnitten von Organen und Geweben mit knöchernem Anteil, wie z. B. die Cochlea, ist zu berücksichtigen, daß vor dem Prozeß der Einbettung der Gewebe, diese zuvor entkalkt werden müssen. Die bisher verwendete Methode der Inkubation der knöchernen Anteile einer Meerschweinchen- oder Ratten-Cochlea mit 20% EDTA in PBS für mindestens 10 Tage bei 37°C führt zur Degradation zellulärer Nukleinsäuren, insbesondere der mRNA, so daß diese sich der Genexpressionsanalyse entziehen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Technical Report: Laser Microdissection and Pressure Catapulting is superior to conventional manual dissection for isolating pure spiral ganglion fractions from the cochlea. Hear Res. 2008, 235(1-2): 8-14
Torkos A, Wissel K, Warnecke A, Lenarz T, Stöver T
