Oberflächenplasmonresonanz-Spektrometer (SPR)
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Gerät wurde im Rahmen unserer Forschung für unterschiedliche Arbeiten eingesetzt. Schwerpunkte bildeten folgende Projekte: 1.) Andockung von Molekülen und Partikeln an Oberflächen In der AG werden unterschiedliche Nanopartikel für die Bioanalytik genutzt. Zum Beispiet können Goldnanopartikel mit Thiolen modifiziert werden um die Oberflächenladung einzustellen. Dies kann dann für die gezielte Erhöhung der Oberflächenkonzentration an Proteinen auf einer Transduceroberfläche genutzt werden. Hierbei sind jedoch die Bedingen in der Lösung zu optimieren um die definierte Assoziation auf der Oberfläche zu erreichen. Hierfür kann die SPR Technologie wertvolle Hilfe leisten. Weiterhin werden in der AG Halbleiterpartikel für den Aufbau lichtschaltbarer Elektroden genutzt. Hier ist neben der Ankopplung der Partikel selbst auch die Immobilisierung der Biokomponente zu optimieren um eine hohe Oberflächenkonzentration sicherzustellen. Hierfür verschiedene Techniken wie z.B. die Layer-by-Layer Methode genutzt werden. So gelang es geeignete Bedingungen für die Fixierung von Glucoseoxidase und Sarcosinoxidase auf den QD-Oberflächen zu finden. Weitere Systeme beschäftigten sich mit der Immobilisierung von DNA über Thiolbindung direkt auf Gold oder auch die Fixierung von Antikörpern über Thiolzwischenschichten auf einer Goldschicht. Dies wurde als Vorarbeit für die Entwicklung eines DNA-basierten Proteinsensors genutzt aber auch für den Aufbau eines Nachweissystems von Viren-DNA, auch wenn in beiden Fällen ein anderes Transduktionssystem zur Anwendung kam. 2.) Protein-Multischichten In der Biosensorik finden Enzyme, die das nachzuweisende Substrat spezifisch umsetzen, eine weite Verwendung. Das Enzym kann auf unterschiedliche Weise an Elektroden immobilisiert werden. Um eine möglichst hohe Beladungsdichte zu erzielen, können sie zusammen mit anderen Materialien in multiplen Schichten aufgebracht werden. Geeignet sind hierfür unter anderem Polyelektrolyte, DNA sowie Nanopartikel aus unterschiedlichen Materialien wie z.B. Siliziumdioxid. Der Aufbau der Schichten erfolgt sukzessiv, wobei die Assemblierung bei niedriger Salzkonzentration und geeignetem pH-Wert hauptsächlich durch elektrostatische Wechselwirkungen erfolgt. Der Vorgang wird mehrmals wiederholt, so dass letztendlich eine dreidimensionale Matrix mit dem Redoxprotein und ggf. auch mit eingebettetem Enzym an der Elektrode vorliegt. Diese Assemblierung - insbesondere aus einer Mischung von Proteinen - muss sehr definiert erfolgen und kann mit Hilfe der SPR Spektroskopie online detektiert werden. So wurde zum Beispiel die Assemblierung von Cytochrom c Mutanten untersucht, aber auch der Schichtaufbau von Cytochrom c und Billirubinoxidase bzw. Cellobiosedehydrogenase. 3.) Charakterisierung von Antikörpern und Aptameren (BiGRUDI) Bei diesem Projekt wurden Antikörper und Aptamere, die gegen bioterroristisch relevante Substanzen (insbesondere Toxine) und Mikroorganismen (einschließlich Viren) gerichtet sind, von uns hinsichtlich ihrer Bindungskinetik und Affinität charakterisiert. Ziel der Arbeiten war es zu bestimmen, ob die neuen von unseren Kooperationspartnern (Robert-Koch-Institut und Freie Universität Berlin) erzeugten Antikörper und Aptamere für die Verwendung in Immunoassays und Biosensoren geeignet sind. Insbesondere wurden Bindungsparameter von Antikörpern bestimmt, die gegen Ricin, Botulinum Neurotoxin, Vacciniaviren oder H5N1-Influenzaviren gerichtet sind. Darüber hinaus wurde auch das Bindungsverhalten für gegen Ricin selektierte Aptamere bestimmt. Unsere Versuche haben gezeigt, dass einige der untersuchten Antikörper sehr gute Bindungseigenschaften aufweisen. Als Konsequenz werden diese von unseren Kooperationspartnern für Nachweissysteme z.B. Immunossays eingesetzt und auch für Multiplex Plattformen adaptiert.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Layer-by-layer assembly of electro-active gold nanoparticle/cytochrome c multilayers. Biosensors and Bioelectronics 25 (2009) 739-744
S. Bonk, F. Lisdat
- Electroactive multilayer assemblies of bilirubin oxidase and human cytochrome c mutants: insight in formation and kinetic behavior. Langmuir 2011 Apr 5;27(7):4202-11
F. Wegerich, P. Turano, M. Allegrozzi, H. Möhwald, F. Lisdat
