Nutzung mikrobieller Rezeptorproteine für Biosensor- und Mikrotiterplattenassays zum Screening auf Tierarzneimittelrückstände in Lebensmitteln
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Zwei rekombinante bakterielle Rezeptorproteine gegen die beiden wichtigsten rückstandsbildenden Tierarzneimittelgruppen (Tetracycline, ß-Lactame) dienten modellhaft dazu, deren Potential für die Entwicklung von analytischen Screeningverfahren zum Nachweis von Tierarzneimittelrückständen an geschlachteten Tieren und Lebensmitteln auszuloten. Das Tetracyclin-Rezeptorprotein TetR (BD) mit je einer spezifischen Bindungsstelle für einen DNA- Abschnitt und für Wirkstoffe aus der Antibiotikagruppe der Tetracycline wurde schwerpunktmäßig für die automatisierbare, einen Tag/Nacht-Betrieb erlaubende Oberflächenplasmonresonanz (SPR)-Biosensoranalytik charakterisiert. Von den verschiedenen möglichen Assayformaten erwies sich das DNA-gestützte nicht-kompetitive Format als am leistungsfähigsten. Für alle veterinärmedizinisch genutzten Tetracycline ließen sich deren Rückstände an und unterhalb der jeweiligen EU-Höchstmengen u.a. in Muskelfleisch und Niere nachweisen, die die wichtigsten Matrices im Rahmen des amtlichen Rückstandskontrollplans darstellen. Nachteil der Biosensoranalytik ist allerdings die Anfälligkeit gegenüber Matrixinterferenzen. Nur ein zuvor ultrazentrifugierter und zusätzlich ultrafiltrierter Extrakt aus essbaren Geweben ließ sich störungsfrei untersuchen. Für das kompetitive Format wurden spezielle Doxycyclinderivate als Kompetitoren synthetisiert und das komplexe Zusammenspiel von Sensorchipoberfläche, Spacerlänge des Kompetitors und Messbedingungen der SPR-Biosensoranalytik untersucht und charakterisiert. Anders als beim nicht-kompetitiven Format war der nach jedem Analysenlauf durchzuführende Regenerationsschritt für die Sensorchip-Oberfläche nicht gleichermaßen reproduzierbar. Die neuartigen Doxyclinderivate sollten sich deshalb besser für die Entwicklung von Mikrotiterplattentests nutzen lassen, die keinen Regenerationsschritt erfordern. Das rekombinante Penicillin-Bindeprotein PBP 2x* ließ sich anders als die natürlichen PBP als nicht-membrangebundenes, lösliches Protein gewinnen. Damit wurden Magnetpartikelgestützte Küvetten- und verschiedene Assayformate von Mikrotiterplattentests (MTP-Tests) entwickelt und charakterisiert. Der MTP-Test mit photometrischer Detektion erlaubte mit Ausnahme von Cefalonium die rückstandsanalytische Erfassung aller anderen 15 in der EU für die Anwendung bei Lebensmittel liefernden Tieren zugelassenen ß-Lactam-Antibiotika. Gegenüber den auf Antikörpern aufbauenden Tests hatte PBP 2x* zwei Vorteile: Penicilline und Cephalosporine wurden erfasst und jeweils nur die Höchstmengen-relevanten Formen mit intaktem ß-Lactamring. Bei der Mehrzahl der untersuchten Matrices (Milch, Ei, Honig, Muskelfleisch und Niere verschiedener Spezies) war eine 1:10-Verdünnung zur Probenvorbereitung ausreichend. Die kostengünstigeren, aber auch arbeitsaufwändigeren MTP-Tests erlaubten einen zuverlässigen Rückstandsnachweis und erwiesen sich gegenüber den Biosensorverfahren als robuster. Sie eignen sich damit sowohl für Kontrollen im Rahmen der amtlichen Lebensmittelüberwachung und zur Eigenkontrolle in der Handelskette, u.a. als preisgünstiges Kontrollverfahren in Entwicklungs- und Schwellenländern vor Lebensmittelexporten in die EU.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2005) A DNA-based optical biosensor assay for tetracycline in milk and honey. Proceedings of the Euro Food Chem XIII Conference, Hamburg, 21.-23. September 2005, Volume 1, S. 150-153
Moeller N, Scholz O, Hillen W, Bergwerff AA, Petz M
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(2005) A new receptor assay for ß-lactam residues in various food matrices. Proceedings of the Euro Food Chem XIII Conference, Hamburg, 21.-23. September 2005, Volume 2, S. 463-466
Lamar J, Hakenbeck R, Petz M
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(2005) Entwicklung eines Rezeptorprotein-gestützten Mikrotiterplattentests auf Rückstände von ß-Lactam-Antibiotika. Jahrestagung der Lebensmittelchemischen Gesellschaft 2005, Regionalverband NRW, Wuppertal. Abstract: Lebensmittelchemie 59:116-117
Lamar J, Hakenbeck R, Petz M
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(2005) Erkenntnisse zur Antibiotikaresistenz als Wegweiser für einen neuartigen Rückstandsnachweis auf Tetracycline mittels SPR-Biosensor. Jahrestagung der Lebensmittelchemischen Gesellschaft 2005, Regionalverband NRW, Wuppertal. Abstract: Lebensmittelchemie 59:110-111 (2005)
Möller N, Scholz O, Hillen W, Bergwerff AA, Petz M
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(2006) Chemometric optimisation of a new receptor assay for cefoperazon and other ß-lactams in various food matrices. 5th International Symposium on Hormone and Veterinary Drug Residue Analysis, Antwerp, May 16-19, 2006. Posterbeitrag
Lamar J, Hakenbeck R, Petz M
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(2006) Detection of incurred residues of penicillins and cephalosporins in reconstituted freezedried raw milk by a surface plasmon resonance-based biosensor assay. 5th International Symposium on Hormone and Veterinary Drug Residue Analysis, Antwerp, May 16-19, 2006. Posterbeitrag
Jongerius-Gortemaker B, Cacciatore G, Boet WC, Lamar J, Petz M, Bergwerff A
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(2006) Development of an SPR assay for tetracyclines following the principles of bacterial tetracycline resistance. 5th International Symposium on Hormone and Veterinary Drug Residue Analysis, Antwerp, May 16-19, 2006. Posterbeitrag
Moeller N, Scholz O, Hillen W, Bergwerff AA, Mueller-Seitz E, Petz M
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(2006) Rückstandsanalyse von Cephalosporinen und Penicillinen in Milch, Fleisch, Honig und Ei mittels des Rezeptorproteins PBP 2x*. Jahrestagung der Lebensmittelchemischen Gesellschaft 2006, Regionalverband NRW, Bonn. Abstract: Lebensmittelchemie 60:132
Lamar J, Hakenbeck R, Petz M
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(2007) A DAN-based assay for tetracycline residues in milk and honey by surface plasmon resonance. 2nd Biacore Food Analysis Symposium, Amsterdam, November 15-16, 2007
Moeller N, Scholz O, Hillen W, Bergwerff AA, Mueller-Seitz E, Petz M
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(2007) A new strategy for the analysis of tetracycline residues in foodstuffs by a surface plasmon resonance biosensor. European Food Research and Technology 224: 285-292
Moeller N, Mueller-Seitz E, Scholz O, Hillen W, Bergwerff AA, Petz M
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(2007) Development of a receptor-based microplate assay for the detection of beta-lactam antibiotics in different food matrices. Analytica Chimica Acta 586:296- 303
Lamar J, Petz M
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(2007) Entwicklung eines optischen Biosensor-Assays mit Elementen aus der Resistenzforschung zum Screening auf Tetracyclin-Rückstände in Lebensmitteln. Dissertation Bergische Universität Wuppertal, Fachbereich Mathematik und Naturwissenschaften
Möller N
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(2007) Entwicklung, Optimierung und Validierung eines rezeptorproteingestützten Mikrotiterplatten-Tests zur Rückstandsanalytik von ß-Lactam-Antibiotika. Dissertation Bergische Universität Wuppertal, Fachbereich Mathematik und Naturwissenschaften
Lamar J
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(2007) Multi-Matrix-Methode zum robusten Rückstands- Screening auf Cephalosporine und Penicilline. Deutscher Lebensmittelchemikertag 2007, Dresden. Abstract: Lebensmittelchemie 61:81
Lamar J, Hakenbeck R, Petz M
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(2007) Vergleichende Untersuchung von Milchproben aus Medikationsstudien mittels Mikrotiterplatten-Rezeptortest, optischem Biosensor, HPLC und Charm II-Test. Deutscher Lebensmittelchemikertag 2007, Dresden. Abstract: Lebensmittelchemie 61:81
Lamar J, Jongerius-Gortemaker B, Suhren G, Hakenbeck R, Cacciatore G, Boet WC, Bergwerff AA, Petz M
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(2008) Optimierung der Arbeitsparameter und Prüfroutinen für Oberflächenplasmonresonanz-Durchflussgeräte zum Einsatz in der Rückstandsanalytik. Deutscher Lebensmittelchemikertag 2008, Nürnberg. Abstract: Lebensmittelchemie 62:88-89
Dau G, Müller-Seitz E, Petz M
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(2008) Quantifizierung von Tetracyclinrückständen in Honig mittels optischem Biosensor. Deutscher Lebensmittelchemikertag 2008, Nürnberg. Abstract: Lebensmittelchemie 62:29
Andree U, Müller-Seitz E, Petz M
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(2009) Beitrag zur Biosensoranalytik von Tetracyclinrückständen in Lebensmitteln mittels Oberflächenplasmonresonanz. Dissertation Bergische Universität Wuppertal, Fachbereich Mathematik und Naturwissenschaften
Andree U
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(2009) Recent applications of surface plasmon resonance biosensors for analyzing residues and contaminants in food. Monatshefte für Chemie (Chemical monthly) 140:953- 964
Petz M
