Asr1p, a novel yeast RNA Polymerase II CTD-binding protein signals alcohol stress to the nucleus
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Asr1p (Alcohol sensitive RING/PHD finger 1 protein) ist ein nicht-essentielles, etwa 36 kDa großes Protein der Bäckerhefe S. cerevisiae. Der N-terminale Bereich (As 1-211) enthält zwei Zink-bindende Domänen, einen RING- und einen PHD-Finger, während der C-terminus keine auffallenden Charakteristika zeigt. Ursprünglich wurde Asr1p als Interaktionspartner des Kernporenproteins Nup116p identifiziert, was bereits erste Hinweise auf einen Kerntransport des Asr1p gab. Tatsächlich shuttelt Asr1p zwischen Cytoplasma und Kern, verbleibt aber nach Zugabe von Alkohol im Zellkern. Der Kernexport von Asr1p wird durch eine N-terminale leucinreiche Kernexportsequenz, die von Xpo1 erkannt wird, vermittelt. Die systematische Analyse des Kernimports von Asr1p identifizierte im C-terminalen Bereich eine kurze Sequenz (As 243- 280), die den Kernimport von Asr1p vermittelt. Dieses Kernimportsignals (NLS) ist in Hefe-Orthologen von Asr1p konserviert und wird von den Importrezeptoren Kap114p, Kap95p, Kap123p, Pse1p und Kap104p direkt erkannt. In vivo sind diese Importine redundant am Kernimport von Asr1p beteiligt, interessanterweise importieren diese Importfaktoren auch Histon H2A. Aufgrund des Vergleichs des Asr1p- und Histon H2A-Importsignals konnte die NLS- Konsensussequenz [R/K]-x2-L-xn-[V/Y]-x2-[V/I]-x-[K/R]-x3-[K/R] abgeleitet werden. Die N-terminalen RING- und PHD-Finger ließen vermuten, daß Asr1p an Ubiquitinierungsreaktionen beteiligt ist. Tatsächlich konnte Asr1p zusammen mit dem E1 Ubiquitin-konjugierenden Enzym und verschiedenen E2 Ubiquitin-aktivierenden Enzymen seine Autoubiquitinierung katalysieren. Es handelt sich bei Asr1p somit um eine Ubiquitin-E3 Ligase, wobei der RING-Finger, nicht aber der PHD-Finger, diese Aktivität vermittelt. Ein erstes Substrat konnte aufgrund eines putativen Calmodulin-bindenden Motivs (As 243 – 280) im C-terminalen Bereich des Asr1p vermutet werden. Im in vitro-Rekonstitutionssystem konnte Asr1p unter physiologischen Calcium-Konzentrationen an Calmodulin binden und dieses zusammen mit dem E1 Enzym und dem E2 Enzym UbcH5a ubiquitinieren. Calmodulin konnte folglich als Substrat der Ubiquitin E3-Ligase Asr1p identifiziert werden. Zur Identifikation weiterer Substrate wurde Asr1p mittels Affinitätschromatografie aus der Hefe isoliert und assoziierte Komponenten durch massenspektrometrische Analyse identifiziert. Dabei konnten alle Core-Untereinheiten der RNA-Polymerase II und weitere Proteine mit transkriptioneller Funktion als Interaktionspartner isoliert werden. In Folge konnte gezeigt werden, dass Asr1p direkt an die C-terminale Domäne der größten Untereinheit der RNA Polymerase II bindet und die beiden größten Untereinheiten der RNA Polymerase II in vivo ubiquitiniert. Asr1p ist mit unterschiedlichen Phosphorylierungs- und damit Aktivitätsformen der RNAP II assoziiert und könnte demnach eine generelle Rolle bei Inaktivierung und Abbau von Transkriptionskomplexen spielen. Zukünftige Studien sind darauf ausgerichtet, die molekulare Funktion der Ubiquitin E3-Ligase Asr1p bei der transkriptionellen Regulation im Detail zu entschlüsseln.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2007) A novel conserved nuclear localization signal is recognized by a group of yeast importins. J Biol Chem. 282(27):19292-301
Fries T, Betz C, Sohn K, Caesar S, Schlenstedt G, Bailer SM
- (2008) Rtr1 is the Saccharomyces cerevisiae homolog of a novel family of RNA polymerase II-binding proteins. Eukaryot Cell. 7(6):938-48
Gibney PA, Fries T, Bailer SM, Morano KA
- Funktionelle Analyse des Proteins Asr1p der Bäckerhefe und ausgewählter Interaktionspartner. Dissertation, Medizinische Fakultät der Universität des Saarlandes (2010)
Fries, T.
- (2011) The Saccharomyces cerevisiae ubiquitin E3 ligase Asr1p targets calmodulin for ubiquitylation. Biochem Biophys Res Commun. 411(1):197- 201
Fries T, Frank R, Bailer SM
