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Sensing, signal transduction, and conformational coupling of the transporter BetP and the two component system MtrAB from Corynebacterium glutamicum

Fachliche Zuordnung Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
Förderung Förderung von 2005 bis 2014
Projektkennung Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 5448153
 
Erstellungsjahr 2014

Zusammenfassung der Projektergebnisse

Das sekundäre aktive, Na+-gekoppelte Betain-Aufnahmesystem BetP aus dem Bodenbakterium Corynebacterium glutamicum ist eine wichtige Komponente der bakteriellen Antwort auf osmotischen Stress. BetP zeichnet sich im Vergleich zu anderen sekundären Transportern dadurch aus, dass es nicht nur katalytische (Betaintransport) sondern auch sensorische und regulatorische Funktionen besitzt (Antwort auf externe Reize). BetP ist eines der am besten untersuchten Transporter, sowohl in funktioneller als auch in strukturbiologischer Hinsicht, und stellt damit im Feld der sekundären Transporter ein Modellprotein dar. In der strukturellen Analyse zeigte sich, dass die einzelnen Protomere des trimeren Transporterkomplexes in unterschiedlichen Konformationen vorliegen, was eine konformative Kopplung zwischen den drei Protomeren als wichtige funktionelle Eigenschaft von BetP nahelegt. Durch die im vorliegenden Projekt erzielten Ergebnisse wurde die quantitative Beschreibung von Struktur und Funktion von BetP in zwei wesentlichen Aspekten erweitert. Im ersten Projektteil untersuchten wir die konformative Wechselwirkung zwischen den Protomeren. Durch unterschiedliche experimentelle Ansätze wurde gezeigt, dass keine funktionell relevante konformative Wechselwirkung zwischen den einzelnen Protomeren stattfindet. Dieses Ergebnis war außerordentlich überraschend, legte die in Kristallen von BetP beobachtete asymmetrische Struktur des Trimers doch solch eine Interaktion nahe. Die in einem Kooperationsprojekt geplanten Untersuchungen zur Dynamik der Konformation einzelner BetP- Protomere mit Hilfe von single-molecule FRET Untersuchungen waren nicht erfolgreich. Im zweiten Projektteil wurde eine rigorose Analyse möglicher Stimuli durchgeführt, durch die BetP in seiner Aktivität reguliert werden kann. Durch Untersuchungen in intakten Zellen von C. glutamicum wurde gezeigt, dass neben der schon in früheren Arbeiten definierten chemischen Stimulierung durch hohe Konzentrationen von K+ Ionen im Cytoplasma ein zweiter, physiologisch ungleich wichtigerer Stimulus existiert, der bisher übersehen worden war. Dieser zweite Stimulus ist von internen Ionen unabhängig und beruht auf der Änderung physikalischer Eigenschaften der Membran, in die BetP eingebettet ist. Durch gezielte Variation zellinterner und externer Parameter konnten die beiden Stimuli unter in vivo Bedingungen eindeutig differenziert werden. Die cytoplasmatische K+-Konzentration als grundlegender Stimulus für BetP erwies sich, obschon mechanistisch erforderlich, in der funktionellen Analyse überraschenderweise als physiologisch irrelevant, während der zweite, membrangebundene Stimulus unter physiologischen Bedingungen als dominanter Regulationsparameter für das An- und Abschalten der BetP Aktivität verantwortlich gemacht werden konnte. Durch die im Projekt erzielten Ergebnisse wurde die Kenntnis von Struktur und Funktion des Modell-Transporters BetP wesentlich erweitert. Neben ihrer Bedeutung für BetP sind diese Ergebnisse auch für Struktur und Funktion von Transportern im Allgemeinen wichtig.

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