Exploring topoisomer distributions in minichromosomes to characterize geminiviral dynamics
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Geminiviren sind wichtige Pflanzenpathogene, die große Schäden an Kulturpflanzen wie Bohnen, Mais, Maniok, Tomate, Weizen und Zuckerrübe vor allem in den Tropen und Subtropen, zunehmend aber auch in gemäßigten Breiten, anrichten. Ihre zirkuläre einzelsträngige DNA wird in der Zelle von Wirtsenzymen zur doppelsträngigen DNA komplettiert, die um Pflanzenhistone gewickelt wird und dadurch ein virales Minichromosom bildet. Diese Minichromosomen können verschiedene Zustände einnehmen, um die bidirektionelle Transkription und die weitere Replikation zu programmieren. Diese Genregulation könnte durch Methylierung der DNA bestimmt sein. Zudem wird die Methylierung als Abwehrmechanismus der Pflanze diskutiert, da klonierte vollständig methylierte DNA nicht mehr infektiös ist. Das Verständnis der Modifikation von viralen Minichromosomen könnte somit Ansatzpunkte für eine gezielte Resistenzzüchtung liefern. Auf diesem Hintergrund, war es das Ziel dieses Projektes, die Dynamik der minichromosomalen Struktur während des Infektionsverlaufs zu bestimmen. Da die Nukleosomenstruktur der Minichromosomen sich in der Anzahl der superhelikalen Windungen der DNA abbildet, wurde methodisch die Topoisomerenverteilung als Indikator für offene und kondensierte Minichromosomen genommen und nach Reinigung der Gesamt-DNA oder der Nukleoprotein-Komplexe durch Southern-Blot-Hybridisierung bestimmt. Dabei zeigte sich, dass die Dynamik der Virusvermehrung sehr gut durch diese Technik dargestellt werden kann, dass es aber keinen typischen Infektionsverlauf gibt. Je nach Jahreszeit, Umweltbedingungen im Gewächshaus wie in Klimakammern, gibt es große Unterschiede im Verlauf. Demgegenüber erwies sich die offen zirkuläre doppelsträngige DNA unerwarteter Weise als besonders konstant und konnte so als interner Standard gewertet werden. Für das Abutilon-Mosaik-Virus und das Tomato yellow leaf curl Sardinia virus sind sehr umfangreiche Versuche zum Methylierungsgrad der viralen DNA mit Hilfe von methylierungssensitiven und -abhängigen Restriktionsenzymen durchgeführt worden. Zudem wurde eine neue Methode entwickelt, um mit einer Rolling circle amplification und Bisulfit-Sequenzierung die Orte der Methylierung zu ermitteln. Entgegen der vielfach publizierten Annahme, zeigten diese Untersuchungen, dass relativ wenig geminivirale DNA tatsächlich methyliert ist, und dass eine heterogene lineare doppelsträngige DNA davon viel eher betroffen ist als die zirkuläre superhelikale doppelsträngige DNA, während offen zirkuläre doppelsträngige DNA offensichtlich frei von Methylierung ist. Die Rolling circle replication wie die Rekombinations-abhängige Replikation der Geminiviren scheinen beide Mechanismen zu sein, die die Methylierung effizient vermeiden helfen. Die entwickelten Methoden können nun eingesetzt werden, um bei der Resistenzzüchtung die Dynamik der Virulenz von Geminiviren lange vor der Entwicklung von Symptomen verläßlich zu verfolgen und eine gezielte Stärkung der Abwehrmechanismen zum Beispiel durch posttranskriptionelles und transkriptionelles Gene Silencing zu befördern. Weitere Informationen hierzu unter http://www.uni-stuttgart.de/bio/bioinst/molbio/.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2009). Strukturanalysen geminiviraler DNA. Dissertation. University of Stuttgart
Paprotka, T.
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(2010). Replicative intermediates of Maize streak virus found during leaf development. J. Gen. Virol. 91, 1077-1081
Erdmann, J. B., Shepherd, D. B., Martin, D. P., Varsani, A., Rybicki, E. P., and Jeske, H.
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(2011). Conformation-selective methylation of geminiviral DNA. J. Virol. 85, 12001-12012
Paprotka, T., Deuschle, K., Metzler V., and Jeske, H.
