Strukturelle und funktionelle Charakterisierung integraler Membranproteine mit Hochdruck als thermodynamischem Werkzeug
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Membranproteine, deren Funktionalität von der Bildung von transienten Komplexen (hier Dimerisiemng) abhängt, sind damit sehr sensitive Sensoren gegenüber Umgebungsfaktoren wie Temperatur oder Druck, die ihre Aktivität und darüber die Anpassung an veränderte Bedingungen über den Kontakt zueinander regulieren können. Hochdruck ist ein wenig genutztes, aber äußerst leistungsfähiges Werkzeug, mit dem die Interaktion von Membranproteinen untersucht werden kann. Hierbei können nicht nur neue Einblicke in die Funktionsweise der Membranen von Tiefseeorganismen, die unter extremen Temperatur- und Druckbedingungen leben, gewonnen werden, sondem auch ein grundsätzliches Verständnis der Funktion von Membranproteinen selbst. Es wurde erstmals Hochdruck als thermodynamisches Werkzeug für die Modulation der Aktivität von Membranproteinen eingesetzt, die als Umweltsensoren (ToxR) bzw. Transportproteine (LmrA und HorA) fungieren. Ziel der Untersuchungen war es, herauszufinden, inwieweit die Funktionalität von Membranproteinen von deren Struktur selbst abhängt und/oder über Veränderungen in der Lipidumgebung bzw. lateralen Membranorganisation moduliert werden kann. Durch die Verwendung von Hochdruck zur Beeinflussung der Membranstruktur kann ein (störender) Einfluss von Temperatur (thermischer Energie) auf vielfältige zelluläre Prozesse vermieden werden. Weiterhin erlauben diese Untersuchungen Einblick in membranassoziierte Prozesse von Tiefseeorgansimen, die teilweise Drücken bis 1000 bar standhalten müssen. Untersuchungen wurden sowohl in vitro, in künstlichen Membranen mit eingebauten definierten Proteinen (Proteoliposomen), als auch in vivo, in bakteriellen Reporterstämmen (Escherichia coli, Photobakterium profundum - ein Tiefseebakterium) durchgeführt. Sowohl die Lipidmatrices als auch die Struktur der Membranproteine wurden variiert. In allen verwendeten Systemen war die Funktionalität der untersuchten Proteine (Signaltransduktion bzw. Transport) von deren Dimerisierung abhängig. Zusätzlich wurden druckabhängige Untersuchungen an der Na+, K+-ATPase in natürlicher Membranumgebung sowie in unterschiedlich rekonstituierten Lipidmembran-Systemen durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass die Dimerisierung von Membranproteinen sehr sensitiv gegen Umgebungsfaktoren ist. Während Dimere aus Membranproteinen bereits bei Drücken < 500 bar zerfallen, sind bei wasserlöslichen, cytoplasmatischen Proteinen hierfür höhere Drücke erforderlich, die in der Umwelt (aufder Erde) nicht auftreten (1-8 kbar, je nachdem ob es sich um oligomere oder monomere Proteine handelt). Dabei wird die Fähigkeit zur Dimerisierung und damit die Funktionalität dieser Membranproteine wesentlich von der Struktur des Proteins, insbesondere des in der Membran liegenden Teils des Proteins, bestimmt. Bei hohen Drücken werden hydrophobe Interaktionen, welche auch für die Dimerisierung mit verantwortlich sind, geschwächt. Zudem müssen Hydrophobizität und Länge der Transmembrandomänen hierfür zur umgebenden Lipidmatrix passen. Der Phasenzustand (z.B. fluid oder geordnet) und Phasenübergänge (z.B. fluid/Gel oder fluid-ungeordnet/fluid-geordnet) wurden dagegen von Hochdruck < 500 bar kaum beeinflusst. Zudem wirken die Bakterien in den in vivo Versuchen einer Veränderung der Membranstruktur durch Veränderung der Lipidzusammensetzung entgegen (Homeoviskose Adaptation). Bei Drücken bis 2000 bar, die in vitro an Proteoliposomen angewandt wurden, kann dagegen - je nach Lipidzusammensetzung - nicht nur eine Dissoziation der Dimere, sondem ggf. auch deren Stabilisierung eintreten, so dass deren Funktionalität erhalten bleibt. Während sowohl in vivo als auch in vitro die Proteinstruktur maßgeblich für die Funktionalität der untersuchten Membranproteine ist, treten die über die Lipidstruktur vermittelten modulierenden Effekte nur in vitro und bei höheren Drücken signifikant auf.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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"Fluorescence Spectroscopic Studies of Pressure Effects on Na+, K+-ATPase Reconstituted into Phospholipid Bilayers and Model Raft Mixtures". Biochemistry 46 (2007) 1672-1683
E. Powalska, S. Janosch, E. Kinne-Saffran, R. K. H. Kinne, C. F. L. Fontes, J. A. Mignaco, and R. Winter
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"Influence of High Pressure on the Dimerization of ToxR, a Protein Involved in Bacterial Signal Transduction". Appl. Environ. Microbiol. 74(2008) 7821-7823
K. Linke, N. Periasamy, M. Ehrmarm, R. Winter, and R. F. Vogel
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"Effect of Pressure on Membranes". Sofi Matter 5 (2009) 3157-3173
R. Winter and C. Jeworrek
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"Effects of Temperature and Pressure on the Lateral Organization of Model Membranes with Functionally Reconstituted Multidrug Transporter LmrA". Biochim. Biophys. Acta (Biomembranes) 1788 (2009) 390-401
N. Periasamy, H. Teichert, K. Weise, R. F. Vogel, and R. Winter
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"Influence of Membrane Lipid Composition on the Activity of Functionally Reconstituted LmrA under High Hydrostatic Pressure". High Pressure Research 29 (2009) 344-357
H. Teichert, N. Periasamy, R. Winter, and R. F. Vogel
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"Influence of Membrane Organization on the Dimerization Ability of ToxR from Photobacterium Profundum under High Hydrostatic Pressure". High Pressure Research 29 (2009) 431-442
K. Linke, N. Periasamy, E. A. Eloe, M. Ehrmann, R. Winter, D. H. Bartlett, and R. F. Vogel
