Nachweis von Punktmutationen mit Hilfe photoelektronischer Wechselwirkungen zwischen zwei fluoreszenten Basensurrogaten
Organische Molekülchemie - Synthese, Charakterisierung
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Ziel des Projektes war die Herstellung und Entwicklung von DNA-Sonden, die den Nachweis von DNA-Einzelbasenmutationen über Fluoreszenz ermöglichen. Dabei sollte auf die Verwendung von Enzymen gezielt verzichtet werden. Im Fokus der synthetisierten DNA-Sonden stand die Zweifachmodifikation mit organischen Chromophoren, durch deren photoelektronische Wechselwirkungen der Nachweis von Einzelbasenmutationen über entsprechende Basenfehlpaarungen gelingen sollte. Zu Beginn des Projektes lag der Fokus der Arbeiten auf photoinduzierten Ladungstransferprozesse zwischen einer Fluoreszenzsonde als DNA-Basensurrogat und einer weiteren artifiziellen DNA-Base, die die Fluoreszenz löscht. Das Ziel der ersten beiden Förderperioden bestand darin, auf Basis des DNA-übertragenen Ladungstransfers Donor-Akzeptor-Kombinationen zu synthetisieren und fluoreszenzspektroskopisch zu evaluieren. In diesen DNA-Sonden befanden sich fluoreszenter Ladungsdonor und Ladungsakzeptor in einem Oligonukleotid, das den Sensorstrang darstellt. Die Effizienz des Ladungstransfers wurde durch die Löschung der Fluoreszenz des Ladungsdonors bestimmt und sollte sich nach Hybridisierung mit einem fehlgepaarten bzw. beschädigten Probenstrang von dem richtig gepaarten bzw. unbeschädigten Duplex unterscheiden. Dieses Konzept wurde DETEQ genannt (DETEQ=Detection by Electron Transfer-Controlled Emission Quenching). Trotz anfänglicher Erfolge und nachfolgender intensiver Bemühungen konnte keine Donor-Akzeptor-Kombination gefunden werden, die ausreichende Fluoreszenzkontraste darstellte, um für die Entwicklung einer DNA-Sonde und den Nachweis von DNA-Fehlpaarungen herangezogen zu werden. Am vielversprechendsten waren die Kombinationen aus Ethidium als Basensurrogat bzw. pyrenmodifiziertem Guanin als Ladungsdonor in Kombination mit 7-Deazaguanin als Ladungsakzeptor, mit denen eine deutliche Unterscheidung zwischen richtigen und fehlgepaarten Sequenzen gelang. Allerdings sind die Fluoreszenzintensitätsunterschiede nicht ganz im Bereich einer Größenordnung (Faktor 10), um als guter Ausgangspunkt für die Weiterentwicklung in DNA-Assays (z. B. für p53, wie im Antrag zur zweiten Förderperiode formuliert) zu dienen. Deshalb musste für die Arbeiten zur dritten Förderperiode ein deutlicher Paradigmenwechsel erfolgen und das Konzept der Ladungstransferprozesse auf andere photoelektronische Wechselwirkungen ausgedehnt werden. Im Rahmen der letzten Förderphase dieses Projektes wurde das Konzept doppelt markierter Oligonucleotide beibehalten. Statt des Elektronentransfers wurden excitonische und excimerartige Wechselwirkungen sowie Energietransferprozesse zwischen zwei fluoreszenten DNA- Basensurrogaten aufgebaut, um eine Fluoreszenzfarbe zusätzlich zu der des einzelnen Farbstoffes (Monomeremission) zu erzeugen. Dieser Ansatz gelang sowohl mit Perylenbisimiden als auch mit Thiazolorange/Thiazolrot als fluoreszente artifizielle DNA-Bausteinen. Die erste Fluoreszenzfarbe zeigt die richtige Basenpaarung an, während die zweite Fluoreszenzfarbe als Signal für die falschen Basenpaarungen zur Verfügung steht. Damit konnte auch eine Quantifizierung des richtig gepaarten Duplexes in einem Gemisch fehlgepaarter erreicht werden. Im Gegensatz zu FRET-basierten Systemen aus entsprechend doppelt markierten Oligonucleotiden funktionieren die hier verwendeten Wechselwirkungen nur über sehr kurze Reichweiten und reagieren daher sehr empfindlich auf lokale Veränderungen der DNA-Konformation, wie sie typischerweise durch Basenfehlpaarungen erzeugt werden. Die bahnbrechenden Resultat über die „DNA-Ampel“ („DNA traffic lights“) bestehend aus Thiazolorange und Thiazolrot erhielt die Titelseite eines Heftes von Eur. J. Org. Chem. 2010 und die innere Titelseite eines Heftes der Zeitschrift Angew. Chem. Das Ziel des Projektes wurde erreicht. Die von uns entwickelten DNA-Sonden stellen sehr leistungsfähige Werkzeuge für die fluoreszente Bioanalytik mit einem breiten Anwendungsspektrum dar. Sie sind nicht nur als „Molecular Beacon“ für den Nachweis von Einzelbasenmutationen geeignet, sondern auch potentiell für die Echtzeit-PCR, die molekulare Diagnostik und die Bildgebung lebender Zellen durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie genannt. Erste Ergebnisse zur fluoreszenten Bildgebung des Transportes von si-RNA in Zellen und der Farbumschlag von rot nach grün bei der RNA-Prozessierung innerhalb der Zellen liegen bereits vor. Darüber hinaus ist es wichtig hervorzuheben, dass wir hier ein neues Konzept vorstellen, das sehr vielversprechend für die Entwicklung weiterer bioanalytischer Werkzeuge ist. Werden zwei Chromophore als Basensurrogate in DNA durch die diagonale Interstrang-Orientierung in räumliche Nähe zueinander gezwungen, kann eine deutlich verbesserte Energietransfereffizienz als mit konventionellen, über flexibile Alkylketten angeknüpfte Fluoreszenzsonden erreicht werden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Phenanthridinium as an Artificial Base and Charge Donor in DNA. Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 1845-1847
N. Amann, R. Huber, H.-A. Wagenknecht
- Detection of Single Base Mismatches and Abasic Sites Using Phenanthridinium as an Artificial DNA Base and Charge Donor. Org. Biomol. Chem. 2005, 3, 36-38
L. Valis, N. Amann H.-A. Wagenknecht
- 8-(Pyren-1-yl)-2’-deoxyguanosine as an optical probe for DNA hybridization and for charge transfer with small peptides. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 3184-3187
L. Valis, E. Mayer-Enthart, H.-A. Wagenknecht
- Structure-sensitive and self-assembled helical pyrene-array based on DNA architecture. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 3372-3375
E. Mayer-Enthart, H.-A. Wagenknecht
- Perylene Bisimide Dimers as Fluorescent "Glue" for DNA and for Base-Mismatch Detection. Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 2612-2614
D. Baumstark, H.-A. Wagenknecht
- Pyrene-modified guanosine as fluorescent probe for DNA modulated by charge transfer. Bioorg. Med. Chem. 2008, 16, 100-106
C. Wanninger-Weiß, L. Valis, H.-A. Wagenknecht
- Thiazole Orange and Cy3: Improvement of Fluorecent DNA Probes Using Short Range Electron Transfer. J. Org. Chem. 2008, 73, 4263-4266
F. Menacher, M. Rubner, S. Berndl, H.-A. Wagenknecht
- Fluorescent color readout of DNA hybridization with thiazole orange as an artificial DNA base. Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 2418-2421
S. Berndl, H.-A. Wagenknecht
- Optical, Redox, and DNA Binding Properties of Phenanthridinium Chromophores: Elucidating the Role of the Phenyl Substituent for Fluorescence Enhancement of Ethidium in the Presence of DNA. Chem. Eur. J. 2010, 16, 3392-3402
C. Prunkl, M. Pichlmaier, R. Winter, V. Kharlanov, W. Rettig, H.-A. Wagenknecht
- Photoinduced short-range electron transfer in DNA with fluorescent DNA bases: lessons from ethidium and thiazole orange as charge donors. Phys. Chem. Chem. Phys. 2010, 12, 32-43
C. Prunkl, S. Berndl, C. Wanninger-Weiß, J. Barbaric, H.-A. Wagenknecht
- In-Stem Labeled Molecular Beacons for Distinct Fluorescent Color Readout. Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 7268-7272
C. Holzhauser, H.-A. Wagenknecht
- Ratiometric molecular beacons based on the perylene bisimide chromophore as a dimeric internal DNA base substitution. Photochem. Photobiol. Sci. 2011, 10, 1275-1278
F. Menacher, H.-A. Wagenknecht
