Strukturelle und funktionelle Charakterisierung viraler, bioaktiver Glykopeptide des respiratorischen Synzytialvirus (RSV)
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das F-Protein ist als einziges der drei Hüllproteine für den Infektionsprozess des respiratorischen Synzytialvirus (RSV) essentiell. Neben seiner Fusionsaktivität verfügt dieses Glykoprotein auch über eine rezeptorbindende Eigenschaft und konnte daher die Funktionen der beiden Hüllproteine des Sendaivirus (F und HN) übemehmen. Für den Einbau in die SendaivirushüIIe müsste die cytoplasmafische Domäne des RSV-F Protein gegen den entsprechenden Abschnitt des Sendaivirus F-Proteins ausgetauscht werden. Sendaiviren, die keines eigenes F-Protein exprimierten (SeV-AF), konnten auch in trans mit chimärem RSV F-Protein komplementiert werden. Dieses System erwies sich als überaus wertvoll, um Mutanten des RSV-F-Proteins zu charakterisieren. Neben seinen Aufgaben beim Infektionsprozess ist das F-Protein auch maßgeblich für die zell schädigenden Eigenschaften des Virus verantwortlich. Die Expression eines fusionsaktiven F-Proteins war ausreichend, um eine fulminante Apoptose unter Beteiligung des Transkripfionsfaktor p53 in Epithelzelien auszulösen. Die apoptofischen Epithelzellen wurden in großer Zahl aus dem Epithelverband ausgestoßen. Dieser Vorgang könnte erklären, wie die Infektion zur Obstruktion der Bronchiolen führt und das „pulmonary clearance" beeinträchtigt. Die sekundäre Nekrose der apoptofischen Epithelzellen trägt möglicherweise zur Inflammation der Atemwege bei. Die Fusion von infizierten Zellen mit Makrophagen führte zur "bystander" Apoptose dieser Zellen und könnte für die immunsuppressiven Eigenschaften des Vims verantwortlich sein. Die Pathogenese der RSV-Infektion und vieler ihrer Symptome könnten somit durch die F-Protein-vermittelte Apoptose erklärt werden. Bei der proteolytischen Spaltung des F-Proteins an zwei konservierten multibasischen Sequenzen wird im Fall des bovinen RSV (BRSV) ein glykosyliertes Peptid freigesetzt, das zur Familie der Tachykinine gehört. Dieses sog. Virokinin wird von polarisierten Epithelzellen bidirektional sezerniert und vermag G- Protein-gekoppelte Tachykininrezeptoren zu aktivieren, die von Zellen des Nerven- und des Immunsystems aber auch vielen anderen Zellen des Organismus exprimiert werden. Die Aktivierung des Tachykininrezeptors 1 durch Virokinin führt über die sekundären Botenstoffe cAMP und Ca^2+ zur Aktivierung der Transkriptionsfaktoren CREB und NFAT. Die konstitutive Sekretion von Virokinin durch infizierte Zellen führt zur Internalisierung der Tachykininrezeptoren, so dass die Zellen auch gegenüber zellulären Tachykininen refraktär werden. Da Tachykinine an der Regulation der Immunantwort beteiligt sind, könnte dieser Mechanismus antagonistisch auf die Immunantwort wirken. Virokinin ist für die Replikation in Zellkultur nicht essentiell, wie mit rekombinanten BRSV gezeigt werden konnte, bei denen der entsprechende Abschnitt im F-Protein deletiert wurde. Die Deletionsmutante replizierte im Respirationstrakt gnotobiotischer Kälber zu ähnlichen Titern wie das Eltemvirus. Im Unterschied zu diesem induzierte die Mutante jedoch keine Eosinophilie, was darauf hindeutet, dass Virokinin an der Pathogenese der BRSV-Infektion beteiligt ist. Rekombinante Sendaiviren, die das RSV F-Protein in membrangebundener oder löslicher Form exprimierten, wurden zur Immunisiemng von Mäusen eingesetzt. Mit diesem Virusvektor konnte eine stärkere zelluläre Immunantwort als mit einem rekombinanten Vacciniavims erzielt werden. Obwohl das F-Protein nur ein subdominantes T-Zellepitop besitzt, konnte in B-Zel!-depletierten Mäusen eine protektive Immunantwort gegenüber RSV induziert werden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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"The respiratory syncytial vims fusion protein and its role in pathogenesis" Iowa State University, Department of Veterinary Microbiology and Preventive Medicine, Ames, Iowa, USA, 22. September 2005
Zimmer, G.
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(2005) A chimeric respiratory syncytial virus fusion protein functionally replaces the F and HN glycoproteins in recombinant Sendai virus. J. Virol. 79, 10467-10477
Zimmer, G., Bossow, S., Kolesnikova, L., Hinz, M., Neubert, W. J., Herrler, G.
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„A chimeric respiratory syncytial virus fusion protein functionaly replaces the F and HN glycoproteins in recombinant Sendai virus" Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Virologie (GfV) in Hannover, 16.-19. März, 2005
Zimmer, G., Bossow, S., Hinz, M., Neubert, W., Herrler, G.
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"A transgenic cell line for characterization of the respiratory syncytial virus" Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Virologie (GfV) in München, 15.-18.März2006
Lorek, M., Eckardt, J., Temette, N., Zimmer, G.
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"Bovine respiratory syncytial virus induces a transdifferentiation process in epithelial cells" Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Virologie (GfV) in München, 15.-18.März 2006
Eckardt, J., Lorek, M., Zimmer, G.
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"The respiratory syncytial virus (RSV) F protein - more than a fusion protein" Mikrobiologisches Kolloquium und Kolloquium der Sonderforschimgsbereiche 593 und 395, Philipps-Universität Marburg, 5. Juli 2006
Zimmer, G.
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"The respiratory syncytial virus fusion (F) protein and its role in pathogenesis" Royal Veterinary College, University of London, 22. November 2006
Zimmer, G.
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"The respiratory syncytial virus fusion protein and its role in pathogenesis" Medicai Research Council (MRC) Virology Unit, Glasgow, UK, 31. Januar 2006
Zimmer, G.
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"The respiratory syncytial virus fusion protein induces an epithelial to mesenchymal transition in MDCK cells" XIII. Intemational Conference on Negative Strand Vimses, Salamanca, Spanien, 17.-22. Juni 2006
Eckardt, J., Lorek, M., Zimmer, G.
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(2006) Bovine respiratory syncytial virus lacking the virokinin or with a mutation in furin cleavage site RA(R/K)R109 induces less pulmonary inflammation without impeding the induction of protective immunity in calves. J. Gen. Virol. 87, 1659-1667
Valarcher, J.-F., Furze, J., Wyld, S. G., Cook, R., Zimmer, G., Herrler, G., Taylor, G.
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"Generation of a Sendai virus pseudotype system for characterization of F protein mutants of the respiratory syncytial virus" In: Fleckenstein, B.; Haller, O.; Stamminger, T. (Hrsg.): 3rd European Congress of Virology: Programme and abstracts. Nümberg, Germany, 01.-05.09.2007; Beriin: Meta Data, 2007, S. ?
Lorek, M., Baxmann, D., Bossow, S., Neubert, W.J., Zimmer, G.
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"The fusion protein of respiratory syncytial virus (RSV) activates transcription factor p53 leading to apoptosis and shedding of epithelial cells" In: Fleckenstein, B.; Haller, O.; Stamminger, T. (Hrsg.): 3rd European Congress of Virology: Programme and abstracts. Nümberg, Germany, 01.-05.09.2007; Berlin: Meta Data, 2007, S. 188
Eckardt-Michel, J., Lorek, M., Baxmann, D., Zimmer, G.
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"The proapoptotic properties of viral fusion proteins" Kolloquium des SFB 535, Gießen, 18. Dezember 2007
Zimmer, G.
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(2007) A genetically engineered prime-boost vaccination strategy for oculonasal delivery with poly(d,l-lactic-co-glycolic acid) microparticles against infection of turkeys with avian metapneumovirus. Vaccine 25, 7914-7926
Liman, M., Peiser, L., Zimmer, G., Pröpsting, M., Naim, H. Y., Rautenschlein, S.
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(2007) Recombinant Sendai virus induces T cell immunity against respiratory syncytial virus that is protective even in the absence of antibodies. Cell. Immunol. 247, 85-94
Voges, B., Vallbracht, S., Zimmer, G., Bossow, S., Neubert,W. J., Hobeika, E., Herrler, G., Ehl, S.
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'The respiratory syncytial virus fusion protein, a key factor in RSV pathogenesis" Kolloquium am Institut fur Virologie und Immunbiologie, Universität Würzburg, 24. November 2008
Zimmer, G.
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(2008) The fusion protein of respiratory syncytial virus triggers p53-dependent apoptosis. J. Virol. 82, 3236-3249
Eckardt-Michel, J., Lorek, M., Baxmann, D., Grunwald, T., Keil, G., Zimmer, G.
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(2008): Das F-Protein des respiratorischen Syncytialvirus und seine proapoptotische Aktivität. Doktorarbeit (Dr. rer. nat.), Universität Hannover, 2008
Julia Eckardt-Michel
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(2008): Funktionelle Untersuchung von Mutanten und Chimären des RSV F-Proteins. Doktorarbeit (Dr. rer. nat.), Universität Hannover, 2008
Markus Lorek
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"Induction of apoptosis relies on the fusion activity of respiratory syncytial virus F protein" Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Virologie (GfV) in Leipzig, 18.-21. März, 2009
Eckardt-Michel, J., Lorek, M., Zimmer, G.
