Der calciumabhängige Ionenkanal TRPV6 Identifizierung der Kanal-Untereinheit und von damit assozierten Proteinen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Ziel des Projektes war es das TRPV6 Protein und damit assoziierte Proteine aus Primärzellen anzureichern und zu charakterisieren. Unsere Ergebnisse zeigen, dass TRPV6 als Protein in der humanen Plazenta exprimiert wird. So ist dort hauptsächlich die glykosylierte Form des Proteins in der apikalen Plasmamembran der Syncytiotrophoblastenzellen, die die Blut Plazenta Schranke bilden, lokalisiert. Das TRPV6 Protein konnte erstmals aus mikrosomalen Membranfraktionen mit einer Kombination aus einer Calmodulin- und TRPV6-spezifischen Antikörpersäulen isoliert und eindeutig massenspektrometrisch identifiziert werden. Einige der assoziierten Proteine, die wir mit Affinitätsreinigungen bzw. Pulldown-Assays identifizieren konnten, sind bisher nichl in Zusammenhang mit den TRP lonenkanälen gebracht worden. So führt die Interaktion des Kanals mit dem Protein Cyclophilin B, einem Protein mit Prolyl-Peplidyl cis/trans Isomeraseaktivität zu einer Aktivierung des Kanals. Dieses Protein wirkt ebenfalls an dem zu 75% homologen TRPV5 lonenkanal führt aber hier zu einer Inaktivierung der durch TRPV5 induzierten Calciumaufnahme. Wir konnten Interaktionen für das natürliche Zellsytemen bestätigen, die bislang aus in vitro und heterologen Expressionsversuchen erhalten wurden. So konnten wir in Affinitätsreinigungen und Pulldown-Assays eine Interaktion zwischen dem TRPV6-lonenkanal und Annexinll-S100A10 nachweisen, die für die Lokalisation des Kanals in der Plasmamembran notwendig sind, und wir konnten den endogen in Plazenta exprimierten TRPV6 Kanal über Calmodulin anreichern, welches calcium abhängig die Inaktivierung des TRPV6 Kanals beeinflusst. Neben der zweistufigen Affinitätschromatographie haben wir einstufige Affinitätsreinigungen in Kombination mit Blue Native oder „in tube gel digestion" etabliert, mit denen wir nun in Gegenwart von Calciumionen die Isolierung des TRPV6 Proteins zusammen mit daran assoziierten Proteinen durchführen können. Hierbei konnten wir das TRPV6 Protein als Bestandteil eines hochmolekularen Protein komplexes (MW>440 kD) zusammen mit anderen Proteinen identifizieren, die vermutlich für den transepithelialen Calciumtransport in Syncytiotrophoblasten verantwortlich sind.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2004). Removal of Ca(2+) Channel beta(3) Subunit Enhances Ca(2+) Oscillation Frequency and Insulin Exocytosis. Cell, 119(2):273-284
Berggren PO, Yang SN, Murakami M, Efanov AM, Uhles S, Kohler M, Moede T, Fernstrom A, Appelskog IB, Aspinwall CA, Zaitsev SV, Larsson O, de Vargas LM, Fecher-Trost C, Weissgerber P, Ludwig A, Leibiger B, Juntti-Berggren L, Barker CJ, Gromada J, Freichel M, Leibiger IB, Flockerzi V
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(2005). Transport activity of MCT1 expressed in Xenopus oocytes is increased by interaction with carbonic anhydrase. J Biol Chem 280, 39882-9
Becker HM, Hirnet D, Fecher-Trost C, Sültemeyer D, Deitmer JW
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(2008) The human TRPV6 channel protein is associated with cyclophilin 8 in human placenta. J Biol Chem 283, 18086-18098
Stumpf T, Zhang Q, Hirnet D, Lewandrowski U, Sickmann A, Wissenbach U, Dörr J, Lohr C, Deitmer JW, Fecher-Trost C
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(2010) Antikörper und Massenspektrometrie: hoch effiziente Werkzeuge zur Identifizierung von Biomarkern. Biospektrum 02.10, 16. Jahrgang
Fecher-Trost, C.
