Regulation des inhibitorischen Glycinrezeptors durch Ubiquitinierung
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Unser Projekt zielte darauf ab, die Rolle und den Mechanismus der Ubiquitinierung bei der Regulation der Dichte von Glycinrezeptoren in der Plasmamembran aufzuklären. Ubiquitin ist ein weit verbreitet („ubiquitär") vorkommendes, kleines Protein mit Botenfunktion, das an andere Proteine - einem Adressanhänger ähnlich - angehängt werden kann und damit dessen Schicksal im Zellstoffwechsel mitbestimmt. Die biologische Relevanz des Projektes liegt darin, dass Glycinrezeptoren neben den GABAA-Rezeptoren die wichtigsten hemmenden Neurotransmitter-Rezeptoren im Gehirn darstellen. Da die Informationsverarbeitung im Gehirn ein fein balanciertes Zusammenspiel von aktivierenden und hemmenden Nervenzellen erfordert, ist die genaue Regulation der synaptischen Dichte von hemmenden Rezeptoren für eine ausgeglichene Funktion des Gehirns von großer Bedeutung: bei zu starker Hemmung werden Informationen unterdrückt, bei zu geringer Hemmung kommt es zu einem Informationssturm, der nicht mehr verarbeitet werden kann. Wir konnten in diesem Projekt zeigen, dass die Ubiquitinierung des Glycinrezeptors an mehreren Lysin-Aminosäuren einer großen Polypeptidschleife erfolgt, durch die der in die Plasmamembran eingebaute Glycinrezeptor mit dem Innern der Zelle, dem Cytoplasma, in Verbindung steht. Austausch sämtlicher Anhaftungspunkte für Ubiquitin in dieser cytoplasmatischen Proteinschleife hatte keinen direkten Einfluss auf die signalweiterleitende Funktion des Glycinrezeptors, verhinderte aber die Ubiquitinierung vollkommen. Der Ausfall der Ubiquitinierung führte dazu, dass Glycinrezeptoren in höherer Dichte in der Plasmamembran verblieben, weil offenbar - im Einklang mit unserer Ausgangshypothese - die Adressierung zur Aufnahme des Rezeptors in die Zelle („Internalisierung oder Endocytose") vermindert wurde. Wir machten uns als nächstes auf die Suche nach einer in der Aminosäuresequenz der cytoplasmatischen Schleife enthaltenen Information, welche die Ubiquitinierung - d.h. die Verknüpfung von Ubiquitin an die Anhaftungspunkte des Glycinrezeptors - reguliert. An der Ubiquitinierung sind bekanntermaßen mehrere Enzyme beteiligt. Eines dieser Enzyme ist eine jeweils spezielle E3-Ligase, welche dafür sorgt, dass Ubiquitin nur mit dem „richtigen" Zielprotein verknotet wird. Bei der systematischen experimentellen Analyse entdeckten wir überraschenderweise, dass die Aminosäuresequenz der cytoplasmatische Polypeptidschleife eine ganze Reihe von Informationen enthält, die für den Zusammenbau und die Regulation von Glycinrezeptoren wesentlichen sind und die bisher unbekannt waren. Zusätzlich zu den für die Ubiquitinierung wesentlichen Lysin-Aminosäuren sind dies folgende Aminosäure-Motive: 1. eine Gruppe positiv geladener Aminosäuren, die nahe an der Plasmamembran lokalisiert ist und die richtige Faltung der Glycinrezeptor-Untereinheit durch die Zellmembran wesentlich mitbestimmt; 2. weitere positiv geladenen Aminosäuren, über die Alkohol (Ethanol) einen Teil seiner Wirkung auf Nervenzellen entfaltet, indem an dieser Stelle des Glycinrezeptors unter der Einwirkung von Alkohol die universell als Signalmoleküle fungierenden G-Proteine andocken, und 3. zwei auf den ersten Blick unauffällige Aminosäuren am Ende der cytoplasmatischen Schleife, ohne die Glycinrezeptor-Untereinheiten sich nicht zu einem funktionsfähigen Rezeptor in der typischen pentameren Architektur anordnen können. Die Rolle dieser beiden für die Architektur wichtigen Aminosäuren haben wir eingehend untersucht, weil die Architekturgebende Information bisher ausschließlich in dem Neurotransmitter-bindenden extrazellulären Anteil des Glycinrezeptors gesehen wurde. Wir konnten in diesem Projekt zeigen, dass diese beiden cytoplasmatischen Aminosäuren eine universelle Architektur-gebende Bedeutung für alle Rezeptorfamilien haben, die unter dem Namen der Superfamilie der nikotinischen Acetycholinrezeptoren zusammengefasst werden; dies sind neben den nikotinischen Acetylcholinrezeptoren selbst und den Glycinrezeptoren bestimmte Serotoninrezeptoren und die GABAA-Rezeptoren. Alle diese Rezeptoren sind wichtige Angriffspunkte von Arzneimitteln und Toxinen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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2003. A basic cluster determines topology of the cytoplasmic M3-M4 loop of the glycine receptor al subunit. J. Biol Chem. 278: 16782-16790
Sadtler, S., B. Laube, A. Lasub, A. Nicke, H. Betz, and G. Schmalzing
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2004. Assembly of nicotinic a7 subunits in Xenopus oocytes is partially blocked at the tetramer level. FEBS Lett. 575: 52-58
Nicke, A., H. Thurau, S. Sadtler, J. Rettinger, and G. Schmalzing
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2005. The ß subunit determines the ligand binding properties of synaptic glycine receptors. Neuron 45: 727-739
Grudzinska, J., R. Schemm, S. Haeger, A. Nicke, G. Schmalzing, H. Betz, and B. Laube
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2005. The ß subunit increases the ginkgolide B sensitivity of inhibitory glycine receptors. Neuropharmacol. 49: 945-951
Kondratskaya, E.; Betz, H., Krishtal, O. and Laube, B.
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2006. Molecular determinants for G protein ßg modulation of ionotropic glycine receptors. J. Biol. Chem. 281: 39300-39307
Yevenes, G. E., G. Moraga-Cid, L. Guzman, S. Haeger, L. Oliveira, J. Olate, G. Schmalzing, and L. G. Aguayo
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2007. Molecular basis of gephyrin clustering at inhibitory synapses: role of G- and E-domain interactions. J. Biol. Chem. 282: 5625-5632
Saiyed, T., I. Paarmann, B. Schmitt, S. Haeger, M. Sola, G. Schmalzing, W. Weissenhorn, and H. Betz
