Molekulare Charakterisierung eines hyperton-aktivierten Kationen-Kanals und seiner Regulation in humanen Leberzellen

• Antragsteller: Professor Dr. Frank Wehner
• Fachliche Zuordnung: Anatomie und Physiologie
• Förderung: Förderung von 2002 bis 2007
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 5384930

• Erstellungsjahr: 2007

Zusammenfassung der Projektergebnisse

2.1. Allgemeinverständliche Darstellung der wesentlichen Ergebnisse Fast alle tierischen Zellen beantworten Veränderungen ihres Volumens unter osmotischem Stress mit aktiven Prozessen, die als Mechanismen des "regulatory volume decrease" (RVD, als Antwort auf Zell-Schwetlung) bzw. eines "regulatory volume increase" (RVI, als Antwort auf Zell-Schrumpfung) zusammengefasst werden. Ein wesentlicher Mechanismus des RVD ist die Aktivierung von K+-Kanälen und ein K+- Austrom, der von einer Abgabe von Anionen und Wasser begleitet wird. Eine sehr effiziente Form des RVI ist die Öffnung von Kationen-Kanälen, die für Na+ durchlässig sind; Na+ strömt entsprechend seines Gradienten in die Zelle ein, gefolgt von Anionen und Wasser. Nun ist diese zelluläre Volumenregulation an vielen Prozessen beteiligt, die über die reine Aufrechterhaltung eines konstanten Milieus weit hinausgehen. So ist z.B. eine Öffnung von K+-Kanälen und eine Abnahme des Volumens ein sehr wesentliches Element bei der Initiierung der Apoptose, des programmierten Zelltodes - als eine körpereigene Verteidigung gegen das Entstehen von Tumoren. Umgekehrt könnten die Kationen-Kanäle des RVI an der Proliferation von Zellen (inkl. der Entstehung von Tumoren) beteiligt sein - und genau dies ist die zentrale Aussage unserer Arbeitshypothese. Im ersten Schritt wurden die Eigenschaften des Kationen-Kanals an humanen Leberzellen definiert, wie sie uns im Rahmen von Tumor-Operationen vom Klinikum Dortmund zur Verfügung gestellt werden. Zu diesem "fingerprinting" des Kanals gehörte die Bestimmung seiner Ionen-Selektivität und seiner Hemmbarkeit durch verschiedene Blocker. Um die Aktivität des Kanals mit der Proliferation korrelieren zu können, wurden die wirksamen Hemmstoffe dann an der humanen Tumor-Leberzelllinie HepG2 getestet. Und tatsächlich ließen sich Kanal-Aktivität und Zellvermehrung auf diesem Wege auch gut miteinander in Bezug setzen. Im Weiteren wurde dann die a-Untereinheit des epithelialen Na+-Kanals (ENaC), ein wahrscheinlicher Baustein des Kationen- Kanals, durch ein molekularbiofogisches Verfahren blockiert (siRNA). Das Ergebnis war eine Inhibierung der Kanal-Aktivität, eine Reduktion der Proliferation und eine Hemmung des RVI, sowie eine Blockierung der Mitose der HepG2-Zellen (und zwar in der G2/M-Phase ihres Zellzyklus). Gleichzeitig wurde die Apoptose - als Gegenspieler zur Proliferation - durch sämtliche Maßnahmen, die die Aktivität des Kationen-Kanals herabsetzten, stimuliert. In der Summe zeigen diese Ergebnisse sehr klar, dass der Kationen-Kanal ein wesentlicher Mechanismus der Proliferation in der HepG2-TumorzeHlinie ist und als solcher dem Prozess der Apoptose entgegen gerichtet funktioniert. Die Identifizierung des a-ENaC als molekulares Element des Kationen-Kanals ist in diesem Zusammenhang natürlich sehr bedeutsam. Zurzeit werden mit Hilfe einer speziellen molekularbiologischen Technik, die auf die Identifizierung von Proteinen in Zellmembranen ausgerichtet ist (das "split-ubiquitin yeast two-hybrid system"), die Partner von a-ENaC ermittelt, die am Aufbau des Kationen-Kanals beteiligt sind. Hinzu kommen verschiedene protein-biochemische Verfahren. Die intrazellulären Mechanismen, über die die Aktivierung des Kationen-Kanals unter hypertonen Bedingungen erfolgt, konnten noch nicht präzise definiert werden. Hierzu wird in Kürze ein systembiologischer Ansatz zur Anwendung kommen. 2.2. Ausblick auf künftige Arbeiten und mögliche Anwendungen In der Reihenfolge unserer Präferenz werden unsere zukünftigen Arbeiten folgende Fragestellungen behandeln: 1. Wie wirken sich Hemmstoffe des HICC (bzw. das "gene silencing"des Kanals) tatsächlich auf das Wachstum von Tumoren in Tiermodellen aus? 2. Welche molekularen Komponenten sind am Aufbau des HICC in humanen Hepatozyten beteiligt? 3. Welche (intrazellulären) Signalwege sind an der HICC-Aktivierung beteiligt? Es bleibt abzuwarten, welche Rolle der Kationen-Kanal im Tiermodell beim Wachstum von Tumoren - inkl. der Induktion einer Apoptose - tatsächlich spielen mag. Im interessantesten Fall könnte der Kanal jedoch als medizinisches Target eine außerordentliche Bedeutung gewinnen.

Projektbezogene Publikationen (Auswahl)

• Bondarava M, Li T, Endl E, Wehner F. 2007. Role of hypertonicity-induced cation channels (HICCs) in hepatocyte proliferation and apoptosis. (Göttinger Transporttage, December 10-11, 2007).
  
  
• Bondarava M, Li T, Endl E, Wehner F. 2007. Role of hypertonicity-induced cation channels (HICCs) in hepatocyte proliferation and apoptosis. (Proceedings of the &h International Symposium: Cell Volume Control in Health and Disease, Salzburg, Austria, September 21-24, 2007).
  
  
• Bondarova M, Li T, Wehner F. 2007. Molecular identification of the hypertonicityinduced cation channels in HepG2 cells (Proceedings of the tfh International Symposium: Cell Volume Control in Health and Disease, Salzburg, Austria, September 21-24, 2007).
  
  
• Li T, ter Veld F, Bondarava M, Nürnberger HR, Wehner F. 2005. A novel type of hypertonicity-induced cation channel in primary human hepatocytes. Pflugers Arch 449:856 ( 84th Annual Meeting of the Deutsche Physiologische Gesellschaft, Göttingen, March 6-9, 2005).
  
  
• Li T, ter Veld F, Bondarava M, Nürnberger HR, Wehner F. 2005. Characteristics and regulation of hypertonicity-induced cation channels in primary human hepatocytes 13 (Proceedings of the 5* International Symposium: Cell Volume Control in Health and Disease, Copenhagen, Denmark, September 23-27, 2005).
  
  
• Li T, ter Veld F, Nürnberger HR, Wehner F. 2004. A novel hypertonicity-induced cation channel in primary human hepatocytes. (Proceedings of the International Symposium on Animal Physiology: Proteins in Adaptation and Evolution, Greifswald, June 3-5, 2004).
  
  
• Li T, ter Veld F, Nürnberger HR, Wehner F. 2004. Hypertonie activation of a nonselective cation channel in primary human hepatocytes. (Transporters 2004: International Symposium on Membrane Transport and Transporters, Cambridge, England, September 2-5, 2004).
  
  
• Li T, ter Veld F, Nürnberger HR, Wehner F. 2004. Hypertonie activation of a nonselective cation channel in primary human hepatocytes. Pflugers Arch 447:892 (83rd 12 Annual Meeting of the Deutsche Physiologische Gesellschaft, Leipzig, March 14-17, 2004).
  
  
• Li T, ter Veld F, Nürnberger HR, Wehner F. 2005. A novel hypertonicity-induced cation channel in primary cultures of human hepatocytes. FEBS Lett 579:2087-2091.
  
  
• Li T, ter Veld F, Nürnberger HR, Wehner F. 2005. A novel type of hypertonicityinduced cation channel in primary human hepatocytes (3&h International Congress of Physiological Sciences, San Diego, CA, USA, March 31-April 5, 2005.
  
  
• Li T, ter Veld F, Nürnberger ter Veld F, Li T, Nürnberger HR, Wehner F. 2003. Primary cultures of human hepatocytes in the analysis of cell volume regulation and apoptosis. (Göttinger Transporttage, November 8-9, 2003).
  
  
• Li T, Wehner F. 2007. Regulation of hypertonicity-induced cation channels in primary human hepatocytes (Proceedings of the 6?h International Symposium: Cell Volume Control in Health and Disease, Salzburg, Austria, September 21-24, 2007).
  
  
• Olsen H, ter Veld F, Herbrand U, Ahmadian MR, Kinne RKH, Wehner F. 2007. Differential regulation of cell volume and shape in confluent rat hepatocytes under hypertonic stress. Cell Physiol Biochem 19:259-268.
  
  
• Wehner F, Bondarava M, ter Veld F, Endl E, Nürnberger HR, Li T. 2006. Hypertonicity- induced cation channels. Acta Physiol 187:21-25.
  
  
• Wehner F, ter Veld F, Li T, Endl E, Nürnberger HR, Bondarova M. 2005. Hypertonicity-induced cation channels and their putative role in proliferation and apoptosis (Proceedings of the &h International Symposium: Cell Volume Control in Health and Disease, Copenhagen, Denmark, September 23-27, 2005).
  
  
• Wehner F, ter Veld F. 2005. Role of hypertonicity-induced cation channels in the proliferation and apoptosis of HepG2 cells. Pflugers Arch 449:892 ( 84th Annual Meeting of the Deutsche Physiologische Gesellschaft, Göttingen, March 6-9, 2005.