Funktionelle Kartierung des humanen Tenascin-R
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Eine erfolgreiche Regeneration im Zentralnervensystem (ZNS) nach einer Nervenschädigung erfordert das Wiederauswachsen von Axonen zu ihrem ursprünglichen Zielort und erneute Synapsenbildung, sowie die Remyelinisierung dieser Axone durch myelinbildende Gliazellen, die Oligodendrozyten. Das ZNS höherer Vertebraten - auch des Menschen - zeichnet sich durch ein geringes regeneratives Potential aus, was zum Großteil auf die Präsenz regenerationshemmender, von Gliazellen produzierter Moleküle zurückzuführen ist. Ein solches inhibitorisches Molekül ist das Matrixprotein Tenascin-R (TN-R), das in meiner Arbeitsgruppe identifiziert und funktioneil charakterisiert wurde. TNR wird von Oligodendrozyten produziert und kann (i) das Wiederauswachsen von Axonen verhindern (über die Bindung an das axonale Protein Contactin) und (ii) die Differenzierung, bzw. das Remyelinisierungspotential von Oligodendrozyten fördern (über die Interaktion mit Sulfatiden, an der Zelloberfläche vorhandenen Glykolipiden, und/oder mit Contactin). Die Bindungsstellen für die genannten zellulären Rezeptoren auf dem humanen Protein, sowie von funktionell relevanten, in meinem Labor beschriebenen monoklonalen TN-R-Antikörpern waren jedoch unbekannt. Hinsichtlich der möglichen Anbindung an biomedizinische Anwendungen im Rahmen von Reparaturprozessen in humanem ZNS, wurde deshalb mit Hilfe der Förderung eine funktionelle Kartierung des humanen TN-R-Moleküls vorgenommen. Hierfür wurden rekombinante Proteinanteile/ TN-R-Domänen über TOPO-TA Klonierung in einem humanen (Flpln) Expressionssystem hergestellt. Im Rahmen des Vorhabens ist es zum ersten Mal gelungen, humane TN-R-Fragmente, welche die Gesamtsequenz des Proteins abdecken, als natürlich gefaltete, glykosylierte Proteinfragmente herzustellen und funktioneil zu charakterisieren. Kohlenhydratanalysen mittels pflanzlicher Lektine und kohlenhydratspezifischer monoklonaler Antikörper zeigten, dass das Glykosylierungsmuster der Fragmente jenes des nativen humanen Proteins widerspiegelt. Insbesondere das phylogenetisch stark konservierte, an axonalem Wachstum und Synaptogenese beteiligte HNK-1-Kohlenhydrat konnte bestimmten TN-R-Domänen zugeordnet werden. Mit Hilfe der Fragmente konnten die Bindungsstellen von allen (sechs) monoklonalen TN-R-Antikörpern identifiziert werden. Über den Einfluss zweier Antikörper auf die funktioneilen Eigenschaften definierter Proteinfragmente konnte die Bedeutung der Bindungsepitope für axonales Wachstum und Sulfatid-vermittelte Interaktionen verifiziert werden. Funktionelle Studien zur Contactin-vermittelten inhibitorischen Wirkung des Moleküls auf die axonale Regeneration lieferten das überaschende Ergebnis, das auf dem humanen TN-R zwei Contactin- Bindungsstellen existieren, wobei eine von ihnen für die Wirkung des Gesamtmoleküls ausreichend/verantwortlich ist. Ebenso konnten wir zwei Sulfatid-Bindungsstellen auf dem humanen Molekül identifizieren, wobei die Sulfatid-Hauptbindungsstelle enthaltende TN-R-Domäne alleine für die Adhäsion, bzw. Selektion von Oligodendrozyten und deren Differenzierung (gekennzeichnet durch die Expression myelinspezifischer Proteine und Glykolipide) ausreicht. Aufgrund der möglichen therapeutischen Relevanz der erzielten Ergebnisse hinsichtlich der Entwicklung neuer Behandlungsmethoden bei demyelinisierenden Erkrankungen werden derzeit weitere Untersuchungen mit TN-R-Domänen/Domänenanteilen durchgeführt. Diese Ergebnisse wurden bis dato in Zusammenhang mit der Entwicklung eines von uns patentierten Einstufen-Verfahrens zur Isolierung von Oligodendrozyten angewendet und von unserem Spin-off Unternehmen Heraclitus Biosciences (www.heraclitus-biosciences.com) bis zur Produktreife weiter entwickelt. Unser Geschäftskonzept basiert auf der Entwicklung innovativer Produkte für die Isolierung, Kultivierung und Analyse glialer Gehirnzellen, um hierdurch Universitäten, sowie der Pharmaindustrie Möglichkeiten zur Entwicklung von diagnostischen und therapeutischen Verfahren bei Myelinerkrankungen, wie Multipler Sklerose, zur Verfügung zu stellen. Beim Businessplan Wettbewerb Medizinwirtschaft der Startbahn Ruhr (www.startbahn-ruhr.de) in Herbst 2007 fand unsere Geschäftsidee größte Anerkennung: Heraclitus Biosciences hat den 1. Platz belegt und stieß auch in der Presse auf große Resonanz (Provendis News, Bioforum, Take off, Financial Times Deutschland, General-Anzeiger u.a.).
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Lang DM, Monzon-Mayor M, del Mar Romero-Aleman M, Yanes C, Santos E, Pesheva P. (2008) Tenascin-R and axon growth-promoting molecules are up-regulated in the regenerating visual pathway of the lizard (Gallotia galloti). Dev. Neuroblol. 68: 899-916.
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Pesheva P, Probstmeier R, Lang DM, McBride R, Hsu, N-J, Gennarini G, Spiess E, Peshev Z. (2006) Early coevolution of adhesive but not antiadhesive tenascin-R ligandreceptor pairs in vertebrates: A phylogenetic study. Mol. Cell. Neurosci. 32: 366-386.
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Pesheva P, Probstmeier R. (2006) Tenascin-R trifft Oligodendrozyten: eine stabile Beziehung. BlOforum 1/2006:26-28.
