Plazentaspezifische Expression des bovinen Cyp19-Gens: Isolierung und molekulare Analyse der Transkriptionsfaktoren, die an die cis-aktiven Elemente E-Box2, Hex1 und TSE des Promotors 1.1 binden
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Plazenta-Östrogene wirken während der Trächtigkeit mittels parakriner und autokriner Mechanismen Wachstums fordernd auf die Trophoblasten in der Plazenta selbst. Kurz vor der Geburt schließlich kommt es zu einem durch fötales Cortisol induzierten „Östrogenpeak", der wichtig für die Vorbereitung des Geburtsweges und die Einleitung der Geburt ist. Bei Wiederkäuern besteht ein Zusammenhang zwischen einem zu niedrigen „Östrogenpeak" und Plazentaretention und Dystozie, beides Ursachen für erhebliche wirtschaftliche Schäden. Die Östrogensynthese wird durch das Enzym Aromatase katalysiert. Sie hängt entscheidend von der Expression des aromatasekodierenden Cypl9 Gens ab. Cypl9 besitzt eine Reihe von gewebespezifischen Promotoren. Der plazentaspezifische Promotor beim Rind ist der Promotor 1.1 (Pl.l). Interessanterweise nutzen Schafe und auch Menschen völlig unterschiedliche (nicht homologe) plazentaspezifische Promotoren. In früheren Untersuchungen in vitro und in einem verbreiteten Trophoblastzellmodell menschlichen Ursprungs (Jeg3) haben wir Sequenzmotive entdeckt, darunter die E-Box (-340), die für die Aktivität des Pl.l wichtig sind. Die entsprechenden Transkriptionsfaktoren waren allerdings noch unbekannt. Darüber hinaus standen uns noch keine bovine Trophoblastzellkulturen für Reportergenanalysen zur Verfügung. Ziel unseres Projektes war es, die Transkriptionsfaktoren, die an die Sequenzmotive des Pl.l binden, zu identifizieren. Außerdem sollten die bisher verwendeten Jeg3 Zellen durch ein entsprechendes bovines Trophoblastzellmodell ersetzt werden. Es ist uns gelungen, aus Rinderplazentomen mehrkernige Trophoblastzellen zu gewinnen und diese bis zu 14 Tage lang zu kultivieren. Reportergenanalysen des Pl.l in diesen primären Trophoblastzellkulturen lieferten überraschende Resultate. Zwar aktivierte der Pl.l ebenfalls die Reportergenexpression, aber anders als in Jeg3 Zellen führte die gezielte Mutagenese allein der E-Box zur Inaktivierung des Pl.l. Ein vorher mittels Jeg3 Zellen identifiziertes weiteres Promotorelement war in den bovinen Zellen funktionslos. Diese Beobachtung wäre ohne das bovine Trophoblastzellmodell nicht möglich gewesen. Wir haben ein einfaches Verfahren zur Anreicherung E-Box-bindender Transkriptionsfaktoren aus Zellkeraextrakten entwickelt, das auf deren E-Box-spezifischen DNA-Affinität beruht. Unsere Analysen der angereicherten Transkriptionsfaktoren ergaben, dass es sich bei den EBox bindenden Proteinen um die „Upstream Stimulating Factors" (USF) 1 und USF2 handelt, die als Heterodimere an die E-Box (-340) binden. Durch sogenanntes „knockdown" der USF Transkriptionsfaktoren mittels siRNA konnten wir die PI. I -getriebene Reportergenexpression weitgehend abschalten. Cis-aktive (E-Box Mutation) und trans-aktive (USF „knockdown") Faktoren waren also in Bezug auf ihre Wirkungen gleich. Die Resultate unserer Untersuchungen belegen die funktionelle Bedeutung beider USF Proteine als Aktivatoren der Pl.l getriebenen Genexpression. Ganz im Gegensatz dazu wird der plazentaspezifische Promotor des humanen Cypl9 Gens durch die Bindung der USF Proteine gehemmt. Für den Effekt der USF Proteine ist ganz offensichtlich der Promotorkontext entscheidend. Damit zeigt es sich wieder, dass Ergebnisse solcher Promotoranalysen nicht auf andere Spezies übertragbar sind.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Vanselow J, Fürbass R & Tiemann U (2008) Cultured Bovine Trophoblast Cells Differentially Express Genes Encoding Key Steroid Synthesis Enzymes. Placenta 29: 531- 538.
