Mechanische und strukturelle Charakterisierung der Relaxase und des Relaxosoms von bakteriellen Konjugationssystemen

• Antragsteller: Professor Dr. Michael Schlierf
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung seit 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 536234325

Infektionskrankheiten sind eine ständige Bedrohung für den Menschen (Hutchings, Truman und Wilkinson 2019; Podolsky 2018). Allerdings entwickeln sich Krankheitserreger weiter und Bakterien entwickeln und verbreiten Gene, die eine antimikrobielle Resistenz (AMR) gewähren (Ikuta et al. 2022). Die Entwicklung neuer Antibiotika hat sich in den letzten Jahrzehnten verlangsamt, und es müssen neue, alternative Strategien erforscht werden, um die Verbreitung von Resistenzen zu verstehen und einzudämmen (Lewis 2020). Die Ausbreitung von Mehrfachresistenzen erfolgt häufig durch bakterielle Konjugation, dem Hauptweg des horizontalen Gentransfers (Tatum und Lederberg 1947; Arnold, Huang und Hanage 2022). Bei der bakteriellen Konjugation wird typischerweise ein konjugatives Plasmid prozessiert und über einen engen Kanal im Typ-IV-Sekretionssystem (T4SS) von einer Spenderzelle auf eine Empfängerzelle übertragen (Waksman 2019). Einer der wesentlichen vorbereitenden Schritte bei der Konjugation ist die Etablierung eines Protein-DNA-Komplexes am konjugativen Plasmid, der als Relaxosom bezeichnet wird. Während der Relaxosombildung wird das konjugative Plasmid durch das Protein Relaxase und zusätzliche Proteine bearbeitet, die als Komplex das Plasmid erkennen, umgestalten, nicken und aufwinden, um eine einzelsträngige DNA in die Empfängerzelle zu übertragen. Die Relaxase selbst zeigte DNA-Erkennung, DNA-Nicking und kovalente Bindung sowie Helikase-Aktivität (Waksman 2019; Gomis-Rüth und Coll 2006). Dennoch ist das Verständnis der Erkennung und des Umbaus des origin of transfers (oriT) sowie der Helikaseaktivität der Relaxase noch begrenzt. Während der Übertragung der DNA auf die Empfängerzelle bleibt die Relaxase kovalent an die DNA gebunden und wird wahrscheinlich durch Unfoldasen mechanisch entfaltet, da sie zu groß wäre, um durch den engen Sekretionskanal übertragen zu werden (Cabezón et al. 2015). Bis heute ist jedoch unklar, wie stabil die Relaxase ist und ob die Stabilität moduliert werden kann. Es wird angenommen, dass sich die Relaxase nach dem Transfer (teilweise) in einen katalytisch aktiven Zustand zurückfaltet, um das einzelsträngige DNA-Plasmid für die weitere Verarbeitung in der Empfängerzelle wieder zu ligieren. Interessanterweise ist die Rückfaltung nach der mechanischen Entfaltung bei einem großen (>900 aa) Protein mit nicht-repetitiven Abschnitten noch nicht beschrieben worden. Der derzeitige Kenntnisstand über das Relaxosom und die Relaxase selbst ist nach wie vor begrenzt, so dass weitere Forschungsarbeiten erforderlich sind. In diesem Projekt werden wir mit biochemischen Methoden und Einzelmolekülkraftspektroskopie, Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie und korrelativer Mikroskopie (i) die mechanische Stabilität und die Entfaltungs- und Rückfaltungswege von TrwC und seinen Subdomänen, (ii) den schrittweisen Aufbau des Relaxosom-Komplexes, (iii) und die regulierte DNA-Aufwicklungsaktivität der Helikasedomäne der Relaxase untersuchen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen