Induktion einer neuartigen piRNA-Reaktion bei Zebrafischen

• Antragsteller: Professor René Ketting, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Entwicklungsbiologie ; Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung
• Förderung: Förderung seit 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 534955588

Keimzellen zeichnen sich durch leistungsfähige Transposon-Kontrollsysteme aus. Einer dieser Mechanismen ist als PIWI-piRNA-Pathway bekannt, bei dem kleine RNAs (piRNA) an PIWI-Proteine binden und als sequenzspezifische Kofaktoren dienen, um die PIWI-Proteine zu bestimmten Zielen (meist Transposons) zu bringen. Eine wichtige Frage in diesem Bereich ist, wie neuartige Sequenzen in den piRNA-Biogenesemechanismus gelangen können. Insbesondere in Organismen, in denen piRNA-Populationen maternal als RNPs weitergegeben werden, ist derzeit unklar, wie neu eindringende Transposons vom PIWI-piRNA-System erkannt werden können. Wir schlagen vor, dies im Zebrafisch zu untersuchen, einem Wirbeltier, bei dem piRNA-vermitteltes Silencing mütterlicherseits weitergegeben wird. Wir haben kürzlich eine Reihe von Instrumenten entwickelt, mit denen wir die vorgeschlagene Frage angehen können. Ein wichtiges Hilfsmittel für diesen Vorschlag ist ein System, in dem piRNAs auf das Silencing von EGFP abzielen. Dieses System wurde entwickelt, indem wir nach dem Zufallsprinzip viele EGFP-haltige Transposon-Kopien in das Genom einfügten, bis wir auf einen Locus stießen, der das Silencing eines Transgens auslöste, das im genetischen Hintergrund vorhanden war und EGFP in den Keimzellen exprimiert. Die Rückverfolgung des Integrationsortes dieses Transposons wird Aufschluss über die Induktion der piRNA-Produktion geben. Durch die Einkreuzung dieses Systems über das Männchen wird der normalerweise so dominant vorhandene mütterliche Beitrag umgangen, so dass wir den Aufbau einer piRNA-Population im Laufe der Generationen untersuchen können. In dem Vorschlag werden Experimente vorgeschlagen, um dies zu erreichen und allgemein zu analysieren, wie solche piRNA-exprimierenden Loci funktionieren. Außerdem werden Experimente vorgeschlagen, um das entwickelte System zur Untersuchung von piRNA-Defekten in hypomorphen piRNA-Weg-Mutanten zu nutzen. Insbesondere Experimente zur Untersuchung des Kernexports von piRNA-Vorläufertranskripten sind ein wichtiger Aspekt dieses Antrags. Dieser Aspekt des piRNA-Wegs könnte tatsächlich Aufschluss darüber geben, welche Transkripte in den piRNA-Weg eingeschleust werden und welche nicht: ein wichtiger Aspekt, der die Spezifität des Weges bestimmt und das Silencing von Genen verhindert, die in der Keimbahn exprimiert werden müssen. Schließlich schlagen wir vor, auf der Grundlage des EGFP-piRNA-Systems ein genetisches Toolkit zu entwickeln, mit dem ein oder mehrere Gene gleichzeitig in Keimzellen ausgeschaltet werden können, und was die Unterscheidung zwischen somatischen und Keimbahnfunktionen ermöglicht.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen