Größenausschlusschromatographie-System mit Detektoren

• Fachliche Zuordnung: Grundlagen der Biologie und Medizin
• Förderung: Förderung in 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 529276114

In den letzten Jahren wurde immer deutlicher, dass die meisten zellulären Proteine nicht in Isolation funktionieren, sondern sich stattdessen mit anderen Proteinen und/oder Nukleinsäuren zu makromolekularen Komplexen zusammenschließen, um ihre spezifischen Aufgaben zu erfüllen. Einige dieser Komplexe sind außerordentlich stabil, während andere lediglich durch viele schwache molekulare Bindungen zusammengehalten werden. Einblicke in den Aufbau dynamischer Proteinkomplexe zu gewinnen ist nach wie vor eine Herausforderung und erfordert Ansätze, die genaue und quantitative Messergebnisse liefern. Technische Fortschritte in der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) haben solche Komplexe für strukturelle Studien zugänglich gemacht, was zu beispiellosen Einblicken in ihre Wirkungsmechanismen geführt hat. Hier beantragen wir Mittel für die Installation eines mikroskaligen Größenausschlusschromatographie-Systems gekoppelt mit Mehrwinkel-Lichtstreuungsdetektoren (Mikro-SEC-MALS) am Biozentrum der Julius-Maximilians-Universität Würzburg, um Protein- und Protein-Nucleinsäure-Komplexe zu untersuchen, die an verschiedenen zellulären Prozessen beteiligt sind, einschließlich der Genomorganisation, Genexpression, Spleißen, Proteinqualitätskontrolle und -abbau. Im Gegensatz zu klassischen Ansätzen, die Protein-Protein- und Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen weitgehend qualitativ bestimmen, liefert (Mikro-)SEC-MALS Informationen über die absolute Molekülmasse makromolekularer Komplexe mit hoher Genauigkeit und Geschwindigkeit, unabhängig von deren Form oder Sequenz. Sie ist wesentlich einfacher durchzuführen als die analytische Ultrazentrifugation, die große Volumina konzentrierter Proben, kostenintensive Geräte und hochspezialisierte Kenntnisse in der Datenanalyse erfordert, und kann in einem Konzentrationsbereich durchgeführt werden, der für den Nachweis schwacher (mikromolarer) Affinitätswechselwirkungen erforderlich ist; im Gegensatz zu alternativen Methoden, die Proben im nanomolaren Bereich messen, wie z. B. die Massenphotometrie. Das beantragte Instrument wird in der Lage sein, kleinste Mengen von makromolekularen Protein- und Protein-Nukleinsäure-Komplexen über einen weiten Größenbereich aufzulösen und ihre Molekularmassen mit absoluter Präzision zu bestimmen. Diese Eigenschaften werden durch die Kopplung eines analytischen (Ultra-)Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie-Systems ((U)HPLC) mit hochempfindlichen Mikrovolumen-Mehrwinkel-Lichtstreuungs- und Brechungsindex-Detektoren erreicht. Die Integration eines temperierten Autosamplers ermöglicht die Analyse sehr kleiner Probenvolumina, die bei großen und schwer zugänglichen Komplexen oft begrenzt sind. Gleichzeitig ermöglicht der Anschluss eines analytischen Fraktionssammlers die Rückgewinnung getrennter Proben für die nachgeschaltete Verarbeitung, wie z. B. die Kryo-EM, die sich in unseren Forschungsgruppen als die bevorzugte Methode für die Strukturbestimmung makromolekularer Komplexe durchgesetzt hat.

• DFG-Verfahren: Forschungsgroßgeräte
• Großgeräte: Größenausschlusschromatographie-System mit Detektoren
• Gerätegruppe: 1350 Flüssigkeits-Chromatographen (außer Aminosäureanalysatoren 317), Ionenaustauscher
• Antragstellende Institution: Julius-Maximilians-Universität Würzburg
• Leiter: Professor Dr. Christian H. Häring