Charakterisierung des Tryptophan-7-Halogenase-Systems
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Flavin-abhängigen Halogenasen wurden erstmals 1997 beschrieben. Inzwischen hat sich herausgestellt, dass sie in Bakterien sehr weit verbreitet. Es sind diejenigen Enzyme, die hauptsächlich für die Einführung von Halogenatomen (Chlor und Brom) in aromatische Systeme und aktivierte Aliphaten verantwortlich sind. Durch die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur der Tryptophan-7-Halogenase aus der Biosynthese des Antibiotikums Pyrrolnitrin konnte der Reaktionsmechanismus aufgeklärt werden. Im ersten Schritt wird durch eine Flavin-Reduktase aus NADH und FDAD reduziertes FAD gebildet, das dann von der eigentlichen Halogenase gebunden wird. Dort reagiert es mit Sauerstoff zu einem Flavinhydroperoxid. Durch Angriff eines neben dem Flavin im aktiven Zentrum gebundenen Chloridion kommt es zur Bildung von hypochloriger Säure. Diese wird durch einen etwa 10 Ǻ langen Tunnel zum Substrat geführt. Für den Einbau in das Substrat muss die Chlorspezies Wechselwirkungen mit einem Lysin und einem Glutamat eingehen. Austausche dieser beiden Aminosäuren führen zu inaktivem Enzym. Das Substrat ist durch eine Reihe von Aminosäuren über Wasserstoffbrückenbindungen und ionische Wechselwirkungen mit seiner Amino- bzw. Säuregruppe gebunden. Zusätzlich wird es noch durch große aromatische Aminosäuren eingebettet, so dass nur die zu halogenierende Position des Indolrings zugänglich bleibt. Durch die Verwendung anderer Aminosäuren für die Fixierung der Indol-NH-Gruppe und sterischer Einflüsse kann der Indolring im aktiven Zentrum anders orientiert werden, wodurch es zu einer Änderung der Regioselektivität kommt. Dies konnte durch die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur der Tryptophan-5-Haogenase aus der Biosynthese des Antibiotikums Pyrroindomycin gezeigt werden. Austausche der Aminosäuren, die das Substrat binden bzw. einbetten, führen zu einer Verringerung des Km-Werts und der Wechselzahl. Der Nachweis für einen Verlust der Regioselektivität durch den Austausch der Aminosäurereste, die für die unterschiedliche Orientierung des Substrats im aktiven Zentrum besonders entscheidend zu sein scheinen, konnte nicht beobachtet werden. Ein Manuskript zu dieser Thematik ist gerade vom Journal of Molecular Biology zur Publikation angenommen worden. Das Gen einer Flavin-Reduktase die an dem Zweikomponenten- System beteiligt sein könnte, wurde kloniert, das Enzym gereinigt und charakterisiert. Den bisherigen Daten zufolge ist es aber eher unwahrscheinlich, dass die Halogenase und diese Flavin-Reduktase sich zu einem Komplex zusammenlagern.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2008) Biologische Halogenierung. Chem. Ing. Tech., 80, 783-794
Kuetchou Ngnigha, A. R., K. Muffler, A. Ernyei, K.-H. van Pée, R. Ulber
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(2008) New insights into the mechanism of enzymatic chlorination of tryptophan. Angew. Chem. Int. Ed. 47, 9533-9536
Flecks, S., E. P. Patallo, X. Zhu, A. J. Ernyei, G. Seifert, A. Schneider, C. Dong, J. H. Naismith, K.-H. van Pée
