ESI-Ionenfallen Massenspektrometer mit HPLC
Zusammenfassung der Projektergebnisse
1) Es wurden Strukturuntersuchungen von bisher unbekannten Aminosäureoligomeren durchgeführt, die bei der mikrobiologischen Synthese von Cyanophycin auftraten. Bei Cyanophycin handelt es sich um ein nicht-ribosomal synthetisiertes Polymer aus Aminosäuren, welches normalerweise aus einem Asparaginsäure-Rückgrat und Arginin- Seitenketten besteht. Rekombinante Stämme von Saccharomyces cerevisiae sollten eingesetzt werden um Cyanophycin-Derivate zu erhalten, die neben Arginin auch andere Aminosäuren in den Seitenketten enthalten. Die rekombinanten Stämme wurden unter entsprechenden Bedingungen kultiviert und das daraus isolierte Cyanophycin analysiert. Durch den Einsatz der MS-Komponente konnte nachgewiesen werden, dass in dem Polymer neben den beiden bisher bekannten Aminosäurebausteinen auch Ornithin und Citrullin eingebaut wird, wenn Stämme von Saccharomyces cerevisiae entsprechend genetisch verändert werden. 2) Es wurden niedermolekulare Stoffwechselintermediate identifiziert, die bei der Verstoffwechselung von Vorläufersubstraten für die mikrobielle Polythioester- Produktion entstehen. Bei Polythioestern (PTE) handelt es sich um Strukturanaloga von Polyoxoestern, von denen schon seit längerem bekannt ist, dass sie als Speicherstoffe in Bakterien akkumuliert werden. PTEs unterscheiden sich von Polyoxoestern durch den Einbau von Schwefel in das Polymer- Rückgrat. Neben veränderten Eigenschaften, wie z.B. einer höheren Hitzestabilität, zeichnen sie sich vor allem durch ihre Persistenz, also der Nichtabbaubarkeit, aus. Für die biotechnologische Produktion von PTEs werden bisher organische Schwefelverbindungen (organo sulfur compounds - OSC) als Vorläufersubstrate eingesetzt. Um die Umwandlung der Vorläufersubstrate in PTEs nachzuvollziehen, wurden Bakterien isoliert, die diese Vorläufersubstrate als alleinige Kohlenstoff- und Energiequelle verwerten T können. Advenella mimigardefordensis Stamm DPN7 und Variovorax paradoxus Stamm TBEA6 sind zwei der isolierten Bakterienstämme. In ihnen soll der Stoffwechsel dieser OSCs untersucht werden. Die Erkenntnisse aus der Identifizierung der am Stoffwechsel der Vorläufersubstrate beteiligten Enzyme und über die auftretenden Intermediate sollen zur Verbesserung der biotechnologischen PTE-Produktion eingesetzt werden. In diesem Zusammenhang konnte durch die Kombination von HPLC und MS die Struktur von 3-Sulfinopropionyl-CoA, einem Strukturanalogon von Succinyl-CoA, aufgeklärt werden. 3-Sulfinopropionyl-CoA tritt als Intermediat bei der Verstoffwechselung des PTE- Vorläufersubstrates 3,3‘-Dithiodipropionsäure (DTDP) auf. Das in einem Enzymtest gebildete Reaktionsprodukt konnte mittels HPLC von den anderen Komponenten des Enzymansatzes n getrennt werden. Durch die mehrfache Fragmentierung (MS ) der mittels Ionenfalle akkumulierten Zielmoleküle konnte schließlich gezeigt werden, wie eine Sulfinsäuregruppe innerhalb von 3-Sulfinopropionyl-CoA orientiert ist. Gegenwärtig werden andere Intermediate, die während der Verstoffwechselung von OSCs auftreten, untersucht. Hierbei ist der Einsatz einer HPLC-MS im Hinblick auf die Struktursicherung der erwarteten und gebildeten Verbindungen überaus nützlich. 3) Es wurden Strukturuntersuchungen mit Alkylquinolonen, die durch rekombinante Stämme von Pseudomonas putida KT2440 synthetisiert wurden, durchgeführt. 2-Alkyl-4(1H)chinolone (AQs) und deren Derivate sind bakterielle Sekundärmetabolite von Pseudomonas, Alteromonas und Burkholderia spp. mit unterschiedlichen biologischen Aktivitäten. Einige Vertreter sind als Signalmoleküle wichtige Komponenten der quorum sensing-abhängigen Genregulation bei Pseudomonas aeruginosa. Die zur Synthese der AQs notwendigen Gene pqsABCD von P. aeruginosa wurden heterolog in P. putida KT2440 [pBBR-pqsABCD] exprimiert und die synthetisierten AQs wurden mittels HPLC-MS analysiert. Durch die mehrfache Fragmentierung der Ionen konnten AQs mit unterschiedlich langen gesättigten (C3-C13) und einfach ungesättigten (C7-C13) Alkylseitenketten identifiziert werden. 4) Das Gerät wurde für die Quantifizierung von β-Carotinoiden aus Saccharomyces cerevisiae eingesetzt. Ziel der Arbeiten war die Etablierung der Synthese von β-Caroten in der Hefe Saccharomyces cerevisiae, die normalerweise keine Carotinoide synthetisiert. Hierbei wurde vor allem die HPLC-Komponente verwendet. Der integrierte Photodiodenarray- Detektor kann nicht nur bei einer Wellenlänge messen, sondern ermöglicht es, gleichzeitig über einen ganzen Wellenlängenbereich die Absorption zu detektieren Auf diese Art war es möglich β-Carotinoide aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae anhand ihres charakteristischen Absorptionsspektrum während der HPLC-Auftrennung zu identifizieren und anschließend zu quantifizieren.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for production of novel cyanophycins with an extended range of constituent amino acids. 2009 Applied Environmental Microbiology 75: 3437-3446
Anna Steinle, Klaus Bergander, und Alexander Steinbüchel
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Novel reaction of succinyl-CoA synthetase: Activation of 3-sulfinopropionate to 3-sulfinopropionyl-CoA in Advenella mimigardefordensis strain DPN7T during degradation of 3,3’-dithiodipropionic acid. 2011 Journal of Bacteriology
Marc Schürmann, Jan Hendrik Wübbeler, Jessica Grote und Alexander Steinbüchel
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Synthesis and biotransformation of 2-alkyl-4(1H)-quinolones by recombinant Pseudomonas putida KT2440. 2011, Applied Microbiology and Biotechnology 91:1399-1408
Heiko Niewerth, Klaus Bergander, Siri Ram Chhabbra, Paul Williams and Susanne Fetzner
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β-Carotene production by Saccharomyces cerevisiae with regard to plasmid stability and culture media. 2011, Applied Microbiology and Biotechnology
Nicole Lange und Alexander Steinbüchel
