Feld-induzierte Membran- und Zytosolprozesse: Untersuchungen in der Frequenz- (kHz - 200 MHz Bereich) und Zeitdomäne (Nano- bis Mikrosekundenbereich)
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Durch den kombinierten Einsatz von Elektrorotation und Zellvolumetrie gelang es uns erstmals, volumensensitive zuckerleitende Kanäle in der Plasmamembran von verschiedenen humanen und Säugetier-Zellen nachzuweisen und die Bedeutung der Volumenregulation für die Elektrotransfektion und -fusion dieser Zellen zu analysieren. Wir zeigten, dass volumensensitive zuckerleitende Kanäle im Zytosol vieler humaner und tierischer Zelltypen permanent exprimiert sind. Diese Kanäle werden unter stark hypotonen Bedingungen (75-100 mOsm) durch schwellungsbedingte Exozytose in die Plasmamembran eingebaut. Sie sind permeabel für monomere Zucker und impermeabel für Oligosaccharide. Aufgrund der Größenselektivität dieser Kanäle hängt die Volumenregulation von Zellen in hypotonen Medien nicht nur von der Osmolarität, sondern auch von der Zuckerzusammensetzung der Lösung stark ab. Basierend auf den neuen Erkenntnissen zu den Wirkungsmechanismen elektrischer Gleichstrompulse auf Zellen sowie auf der eingehenden biophysikalischen Analyse der elektrischen Zelleigenschaften und der Volumenregulation humaner und Säugetierzellen gelang es uns im Rahmen dieses Projektes, die Effizienz der Elektrotransfektion und der Elektrofusion von wertvollen, medizinisch relevanten Zellen erheblich zu steigern. Der Einsatz stark hypotoner Fusionsmedien ermöglichte es, u.a. die Protokolle zur Elektrofusion von dendritischen und Tumor-Zellen wesentlich zu optimieren. Hierfür war es im Vorfeld der Elektrofusion notwendig, die hypotone Volumenregulation beider Fusionspartner und die damit verbundenen Veränderungen der elektrischen Zelleigenschaften mittels zeitaufgelöster Zellvolumetrie und Elektrorotation detailliert zu analysieren. Die zeitabhängige Zellgröße, die flächenspezifische Membranenkapazität und die zytosolische Leitfähigkeit si erwiesen sich in diesen Experimenten als die bedeutendsten Indikatoren für die Eignung der Zellen für die Elektrofusion und -transfektion von Säugetierzellen. Die biophysikalische Zellanalyse ermöglichte es, das Elektrofusionsprotokoll für dendritische und Tumorzellen hinsichtlich Osmolarität und Zuckerzusammensetzung des Fusionsmediums, Dauer der hypotonen Behandlung, Feldfrequenz für die stabile dielektrophoretische Zellkontaktierung und Feldstärke der Durchbruchspulse schnell zu optimieren. Der in diesem Projekt entwickelte biophysikalische Optimierungsansatz ist generell bei der Elektromanipulation phänotypisch sehr unterschiedlicher Säugetierzellen anwendbar.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2003) Effects of physiological isotonic cryoprotectants on living cells during the freezing-thawing process and effects of their uptake by electroporation: Sp2 cells in alginate-trehalose solutions. Heat Transfer - Asian Research 32:511 -523
Shirakashi R., Müller K.J., Sukhorukov V.L., Zimmermann U.
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(2004) Measurement of the permeability and resealing time constant of the electroporated mammalian cell membranes. Int. J. Heat Mass Transfer 47:4517-4524
Shirakashi R., Sukhorukov V.L., Tanasawa I., Zimmermann U.
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(2005) Surviving highintensity field pulses: strategies for improving robustness and performance of electrotransfection and electrorusion. J. Membrane Biol. 206:187-201
Sukhorukov V.L., Reuss R., Zimmermann D., Held C., Müller K.J., Kiesel M., Gessner P., Steinbach A., Schenk W.A., Bamberg E., Zimmermann U.
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(2006) A biophysical approach to the optimisation of dendritic-tumour cell electrofusion. Biochem. Biophys. Res. Commun. 346:829-839
Sukhorukov V.L., Reuss R., Endter J., Fehrmann S., Katsen-Globa A., Geßner P., Steinbach A., Müller K.J., Karpas A., Zimmermann U., Zimmermann H.
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(2008) A combined patch-clamp and electrorotation study of the voltage- and frequency-dependent membrane capacitance caused by structurally dissimilar lipophilic anions. J. Membrane Biol. 221: 107-121
Zimmermann D., Kiesel M., Terpitz U., Zhou A., Reuss R., Kraus J., Schenk W.A., Bamberg E., Sukhorukov V.L.
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(2008) Effects on capacitance by overexpression of membrane proteins. Biochem. Biophys. Res. Commun. 369: 1022-1026
Zimmermann D., Zhou A., Kiesel M., Terpitz U., Schneider-Hohendorf T., Feldbauer K., Haase W., Bamberg E., Sukhorukov V.L.
