Modulare Organisation von multifunktionellen Peptidsynthetasen und ihre Reprogrammierung
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Nichtribosomale Peptide zeichnen sich durch eine hohe strukturelle Diversität aus, die durch die Anwesenheit vieler nichtproteinogener Aminosäuren im Peptidrückgrat zustande kommt. Sie gelten als pharmakologisch hochinteressante Stoffklasse, da zahlreiche ihrer vielfältigen Vertreter wichtige Bioaktivitäten wie antibiotische, antitumorale oder immunosuppressive Eigenschaften aufweisen. Das Verständnis ihrer Biosynthese, welche von multimodularen Mega-Enzymen, den nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS) gesteuert wird, stellt eine Schlüsselvoraussetzung dafür da, diese Synthese-Maschinerien zur Produktion neuer Therapeutika nutzen zu können. Die NRPS-Template sind aus katalytischen Modulen aufgebaut, die in essentiellen Domänen und Modifikationsdomänen unterteilt sind. Jede dieser Domänen ist für eine chemische Reaktion während der Synthese verantwortlich und kann mit den benachbarten Domänen eine hoch koordinierte Interaktion eingehen. Im durchgeführten Projekt haben wir uns mit mehreren biochemischen und strukturellen Aspekten der essentiellen Domänen für Substraterkennung und Aktivierung (A-Domäne) der Katalyse der Peptidbindung (C-Domäne) sowie mit der Zyklisierungsdomäne (Cy) beschäftigt. Auf biochemischer und struktureller Ebene konnten mehrere A-Domänen und C- Domänen untersucht werden. Es konnten die strukturellen Merkmale für Substraterkennung identifiziert und manipuliert werden und ein neuer Mechanismus für die Katalyse der Peptidbindung in NRPS vorgeschlagen werden. Da diese essentiellen Domänen in jedem Modul vorkommen, haben unsere strukturellen und biochemischen Daten eine allgemeine Gültigkeit für alle bis jetzt bekannten NRPS-Systeme. Die Cy-Domäne, die sowohl Peptidbindung katalysiert und die Zyklisierung von Serinen, Threonin und Cystein-Seitenketten zum entsprechenden heterozyklischen Ring umwandeln, konnten biochemisch zum ersten Mal charakterisiert werden. Die Modifikationsdomänen für Aminosäure-Epimerisierung (E) (Umsetzung von L- in D-Isomere), sowie die Formylierungsdomäne (F) und die externe Thioesterase TE II, die an der Regeneration fehlbeladener NRPS-Module beteiligt ist, wurde auch biochemisch und strukturell untersucht. Die Untersuchungen haben die Grenzen der Domäne innerhalb der Module identifiziert und ermöglicht somit ihre Portabilität bei der Konstruktion von Hybrid-NRPS-Enzymen. Weiterhin wurden Methoden zur in vivo-Manipulation von NRPS-Genclustern entwickelt. Im Rahmen dieses Projektes konnten wir als Erste die intakte 3D-Struktur eines Terminationsmoduls mit vier essentiellen Domänen (C-A-PCP-TE) und deren interdomain-linker-Regionen ermitteln. Es wurde auch eine PCP-C-Bidomänen-Struktur aufgeklärt. Beide Strukturen erlauben die Entwicklung von Methoden zum „Rationellen Design" von Hybrid NRPS und öffnen den Weg zur Synthese von neuen Therapeutika auf der Basis der nichtribosomalen Peptidsynthese.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2002) Evidence for a monomeric structure of nonribosomal peptide synthetases. Chemistry & Biology 9, 997
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Koglin, A., Löhr, F., Bernhard, F., Rogov, V.R., Frueh, D.P., Strieter, E.R., Mofid, M.R., Güntert, P., Wagner, G., Walsh, C.T., Marahiel, M.A. and Dötsch, V.
