Modulare Organisation von multifunktionellen Peptidsynthetasen und ihre Reprogrammierung

• Antragsteller: Professor Dr. Mohamed A. Marahiel
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 1998 bis 2008
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 5159198

• Erstellungsjahr: 2008

Zusammenfassung der Projektergebnisse

Nichtribosomale Peptide zeichnen sich durch eine hohe strukturelle Diversität aus, die durch die Anwesenheit vieler nichtproteinogener Aminosäuren im Peptidrückgrat zustande kommt. Sie gelten als pharmakologisch hochinteressante Stoffklasse, da zahlreiche ihrer vielfältigen Vertreter wichtige Bioaktivitäten wie antibiotische, antitumorale oder immunosuppressive Eigenschaften aufweisen. Das Verständnis ihrer Biosynthese, welche von multimodularen Mega-Enzymen, den nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS) gesteuert wird, stellt eine Schlüsselvoraussetzung dafür da, diese Synthese-Maschinerien zur Produktion neuer Therapeutika nutzen zu können. Die NRPS-Template sind aus katalytischen Modulen aufgebaut, die in essentiellen Domänen und Modifikationsdomänen unterteilt sind. Jede dieser Domänen ist für eine chemische Reaktion während der Synthese verantwortlich und kann mit den benachbarten Domänen eine hoch koordinierte Interaktion eingehen. Im durchgeführten Projekt haben wir uns mit mehreren biochemischen und strukturellen Aspekten der essentiellen Domänen für Substraterkennung und Aktivierung (A-Domäne) der Katalyse der Peptidbindung (C-Domäne) sowie mit der Zyklisierungsdomäne (Cy) beschäftigt. Auf biochemischer und struktureller Ebene konnten mehrere A-Domänen und C- Domänen untersucht werden. Es konnten die strukturellen Merkmale für Substraterkennung identifiziert und manipuliert werden und ein neuer Mechanismus für die Katalyse der Peptidbindung in NRPS vorgeschlagen werden. Da diese essentiellen Domänen in jedem Modul vorkommen, haben unsere strukturellen und biochemischen Daten eine allgemeine Gültigkeit für alle bis jetzt bekannten NRPS-Systeme. Die Cy-Domäne, die sowohl Peptidbindung katalysiert und die Zyklisierung von Serinen, Threonin und Cystein-Seitenketten zum entsprechenden heterozyklischen Ring umwandeln, konnten biochemisch zum ersten Mal charakterisiert werden. Die Modifikationsdomänen für Aminosäure-Epimerisierung (E) (Umsetzung von L- in D-Isomere), sowie die Formylierungsdomäne (F) und die externe Thioesterase TE II, die an der Regeneration fehlbeladener NRPS-Module beteiligt ist, wurde auch biochemisch und strukturell untersucht. Die Untersuchungen haben die Grenzen der Domäne innerhalb der Module identifiziert und ermöglicht somit ihre Portabilität bei der Konstruktion von Hybrid-NRPS-Enzymen. Weiterhin wurden Methoden zur in vivo-Manipulation von NRPS-Genclustern entwickelt. Im Rahmen dieses Projektes konnten wir als Erste die intakte 3D-Struktur eines Terminationsmoduls mit vier essentiellen Domänen (C-A-PCP-TE) und deren interdomain-linker-Regionen ermitteln. Es wurde auch eine PCP-C-Bidomänen-Struktur aufgeklärt. Beide Strukturen erlauben die Entwicklung von Methoden zum „Rationellen Design" von Hybrid NRPS und öffnen den Weg zur Synthese von neuen Therapeutika auf der Basis der nichtribosomalen Peptidsynthese.

Projektbezogene Publikationen (Auswahl)

• (2002) Evidence for a monomeric structure of nonribosomal peptide synthetases. Chemistry & Biology 9, 997
  Sieber, S.A., Linne, U., Hillson, N.J., Roche, E., Walsh, C.T. and Marahiel, M.A.
  
• (2002) Regeneration of misprimed nonribosomal peptide synthetases by type II thioesterases. Proc. Natl. Acad. Sci. 29, 14083-14088
  Schwarzer, D., Mootz, H.D., Linne, U. and Marahiel, M.A.
  
• (2003) Aminoacyl adenylate substrate analogues for the inhibition of adenylation domains of nonribosomal peptide synthetases. ChemBioChem 4, 903-906
  Finking, R., Neumüller, A., Solsbacher, J., Konz, D., Kretzschmar, G., Schweitzer, M., Krumm, T., Marahiel, M. A.
  
• (2003) Demain, des antibiotiques a facon? La Recherche 370, 54-58
  Marahiel, M. A., Kessler, N. and Linne, U.
  
• (2003) Nonribosomal peptides: from genes to products. Nat. Prod. Rep. 20, 275-287
  Schwarzer, D., Finking, R., Marahiel, M. A.
  
• (2003) Systematic and quantitative analysis of protein-protein recognition between nonribosomal peptide synthetases investigated in the tyrocidine biosynthetic template. Biochemistry 42, 5114-5124
  Linne, U., Stein, D. B., Mootz, H. D., Marahiel, M. A.
  
• (2004) Biosynthesis of nonribosomal peptides. Annual Review of Microbiology 58, 453-488
  Finking, R., Marahiel, M. A.
  
• (2004) Mutational analysis of peptidyl carrier protein and acyl carrier protein synthase unveils residues involved in protein-protein recognition. Biochemistry 43, 8946-8956
  Finking, R., Mofid, M. R. and Marahiel, M. A.
  
• (2004) Reactions catalyzed by mature and recombinant nonribosomal peptide synthetases. Methods in Enzymology 388, 293-315
  Linne, U., Marahiel, M. A.
  
• (2004) Structure-based mutational analysis of the 4'-phosphopantetheinyl transferases Sfp from Bacillus subtilis: Carrier protein recognition and reaction mechanism. Biochemistry 43, 4128-4136
  Mofid, M. R., Finking, R., Essen, L.-O., Marahiel, M. A.
  
• (2004) The linear pentadecapeptide gramicidin is assembled by four multimodular nonribosomal peptide synthetases that comprise 16 modules with 56 catalytic domains. J. Biol. Chem. 279, 7413-7419
  Kessler, N., Schuhmann, H., Morneweg S., Linne, U., Marahiel, M.
  
• (2005) Inhibition of the D-alanine:D-alanyl carrier protein ligase from Bacillus subtilis increases the bacterium's susceptibility to antibiotics that target the cell wall. FEBS-Journal 272,2993-3003
  May, J., Finking, R., Wiegeshoff, F., Weber, T., Bandur, N., Koert, U. and Marahiel, M.
  
• (2005) Synthesis of linear gramicidin requires the cooperation of two independent reductases. Biochemistry 44, 8507- 8513
  Schracke, N., Linne, U., Mahlert, C. and Marahiel, M.
  
• (2005) Utility of epimerization domains for the redesign of nonribosomal peptide synthetases. FEBS-Journal 272, 4506-4520
  Stein, D., Linne, U. and Marahiel, M.
  
• (2006) Formylation domain: An essential modifying enzyme for the nonribosomal biosynthesis of linear gramicidin. Journal of the American Chemical Society 128, 7406-7407
  Schönafinger, G., Schracke, N., Linne, U. and Marahiel, M.A.
  
• (2006) Impact of epimerization domains on the intermodular transfer of enzyme-bound intermediates in nonribosomal peptide synthesis. ChemBioChem 7,1807-1814
  Stein, D.B., Linne, U., Hahn, M. and Marahiel, M.
  
• (2007) Mechanistic and structural basis of stereospecific Cbeta-hydroxylation in calcium-dependent antibiotic, a daptomycin-type lipopeptide. ACS Chem Biol. 2,187-196
  Strieker, M., Kopp, F., Mahlert, C., Essen, L.-O., Marahiel, M.A.
  
• (2007) Structural and functional insights into a peptide bond-forming bidomain from a nonribosomal peptide synthetase. Structure 15,781-192
  Samel, S.A., Schönafinger, G., Knappe, T.A., Marahiel, M.A., Essen, L.-O.
  
• (2008) Crystal structure of the termination module ofa nonribosomal peptide synthetase. Science, 321, 659-663
  Tanovic, A., Samel, S., Essen, L.-O. and Marahiel M.A.
  
• (2008) Structural basis for the selectivity of the external thioesterase of the surfactin synthetase. Nature
  Koglin, A., Löhr, F., Bernhard, F., Rogov, V.R., Frueh, D.P., Strieter, E.R., Mofid, M.R., Güntert, P., Wagner, G., Walsh, C.T., Marahiel, M.A. and Dötsch, V.