Hochleistungs-Fluoreszenzmikroskop
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das neu angeschaffte 3-D Imaging System wurde in den ersten drei Jahre von verschiedenen Gruppen am Fachbereich Biologie der Philipps-Universität Marburg für folgende Untersuchungen eingesetzt. In der AG Bölker wurde das Gerät erfolgreich zur Verfolgung endosomaler Vesikel eingesetzt, die bei der Zellteilung von Ustilago maydis Zellen an der Zytokinese beteiligt sind. Während des hefeartigen Wachstums bilden U. maydis Zellen zwei unabhängige Septen aus, zwischen denen sich eine vakuoläre Teilungszone ausbildet. Bei der Steuerung und Koordination dieser Vorgänge spielen kleine GTPasen der hochkonservierten Cdc42/Rac1-Familie eine entscheidende Rolle. Ohne die Aktivierung von Cdc42 unterbleibt die Ausbildung des zweiten Septums und es kommt nicht zur Trennung der beiden Tochterzellen. Durch Expression von fluoreszierenden Fusionsproteinen konnte gezeigt werden, dass der Cdc42-Aktivator Don1 mit den kleinen endosomalen Vesikeln zur Teilungsstelle transportiert wird, wo er dann eine lokale Aktivierung von Cdc42 bewirkt. In einem weiteren von der DFG geförderten Projekt wurde das Gerät bei der chemischgenetischen Analyse der Septenbildung in U. maydis eingesetzt. Dazu wurde die Ste20-artige Kinase Don3 so verändert, dass sie durch einen Kinaseinhibitor spezifisch in vivo gehemmt werden kann. Dadurch konnte gezeigt werden, dass die Kinaseaktivität unabhängig von der Aktivierung von Cdc42 benötigt wird, um die Bildung des sekundären Septums zu ermöglichen. Mit Hilfe der mikroskopischen Analyse konnte ein Modell entwickelt werden, bei der es durch die Kinase zur Markierung eines landmark-Proteins kommt, an dem dann die Deposition von Zellwandmaterial ansetzt, die dann die Invagination des Septums auslöst. Die AG Wegener (Neurobiologie) hat mit Hilfe dieses Systems die Aktivierung von Neuronen in Drosophila melanogaster verfolgt. Dazu wurde vor allem ausgenutzt, dass das angeschaffte System eine Echtzeitmessung von Ca2+ ermöglicht, die durch ein ratio-imaging mit Hilfe bestimmter fluoreszierender Farbstoffe erfolgt, deren Spektrum sich durch Bindung von Calcium- Ionen verändert. Die AG Wegener ist dabei insbesondere an der Ausschüttung von Neuropeptiden interessiert, die zu einer Aktivierung peptiderger Neuronen führen. Die Ausschüttung der Neuropeptide wird durch eine Erhöhung der freien Ca++ Ionen-Konzentration im Zytoplasma ausgelöst. Durch die Darstellung des Verlaufs der Calciumfreisetzung werden auch Hinweise auf mögliche Inputtransmitter ermöglicht. Dies kann zu einer Identifizierung afferenter Neurone führen, die an der Aktivierung beteiligt sind. Die AG Sandrock hat in einem Forschungsvorhaben die Funktion des aktinorganisierenden Forminproteins in dem phytopathogenen Pilz U. maydis untersucht. Dabei zeigt sich, dass Mutanten, die kein Formin mehr exprimieren, in ihrem filamentösen Wachstum gestört sind. Bei der mikroskopischen Untersuchung der Zellen auf Pflanzenoberflächen fiel auf, dass in diesen Filamenten keine Retraktionssepten mehr eingezogen werden. Dies führt dazu, dass die erreichbare Gesamtlänge sehr stark eingeschränkt ist. Ausserdem wurde beobachtet, dass es nur noch in kürzeren Hyphen zur Ausbildung von Infektionsstrukturen auf der Pflanzenoberflächen kommt. Dies führt zu einer deutlichen Reduktion der Pathogenität in diesen Mutanten.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2009) Coordination of cytokinesis and cell separation by endosomal targeting of a Cdc42-specific GEF in Ustilago maydis. Mol Biol Cell 20, 1081-1088
Schink, K.O. and Bölker, M.
- (2009) The germinal centre kinase Don3 triggers the dynamic rearrangement of higher-order septin structures during cytokinesis in Ustilago maydis. Mol Microbiol. 74, 1484-96
Böhmer C, Ripp C, Bölker M
- (2011) Septation of infectious hyphae is critical for appressoria formation and virulence in the smut fungus Ustilago maydis. PLoS Pathog. 7, e1002044
Freitag, J., Lanver, D., Böhmer, C., Schink, K.O., Bölker, M. and Sandrock, B.
- (2012) Chemical Genetics — A Versatile Method to Combine Science and Higher Level Teaching in Molecular Genetics. Molecules, 17, 11920-11930
Sandrock, B.
- (2012) Cryptic peroxisomal targeting via alternative splicing and stop codon readthrough in fungi. Nature 485, 522-525
Freitag, J., Ast, J. and Bölker, M.
