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Projekt
TIRF Mikroskop für Einzelmolekül-FRET Anwendungen
Fachliche Zuordnung
Grundlagen der Biologie und Medizin
Förderung
Förderung in 2022
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 512024179
Die Beobachtung der Aktivität von biomolekularen Maschinen auf Einzelmolekülebene hat das Verständnis unzähliger biologischer Prozesse revolutioniert. Die Entdeckung der „Hand-über-Hand“-Bewegung von Kinesin Motoren entlang Mikrotubuli oder die Rotation der ATP Synthase sind hierfür hervorragende Beispiele. Während sich die Bewegungen von Biomolekülen entlang linearer Polymere, wie z.B. den Komponenten des Cytoskeletts, mithilfe herkömmlicher Fluoreszenzmikroskopie-Technologien verfolgen lassen, erlaubt die Anwendung von Förster Resonanzenergietransfer-Methoden zusätzlich den Nachweis dynamischer Bewegungen innerhalb einzelner Makromoleküle im unteren Nanometerbereich (single-molecule fluorescece resonance energy transfer, smFRET) .Mit diesem Antrag ersuchen wir um Mittel für die Anschaffung eines Totalreflexions (TIRF)-Mikroskops für die Erforschung der Dynamik molekularer Komplexe, welche die dreidimensionale Organisation eukaryotischer Genome kontrollieren, mittels Einzelmolekül- Mikroskopiemethoden. Die an diesem Antrag beteiligten Forschungsgruppen haben ein gemeinsames zentrales Interesse an Proteinmaschinen, die an DNA und Chromatin bindenden und deren Topologie und damit ihre Funktion während des Zellzyklus ändern. Hierunter fallen Transkriptionsfaktor-Komplexe, welche für Promoter-Enhancer Interaktionen über weite Distanzen verantwortlich sind, oder Motorproteinkomplexe, welche für die enzymatische Ausbildung von DNA-Schleifen verantwortlich sind. Die Entschlüsselung der komplexen molekularen Mechanismen dieser molekularen Maschinen bedarf einer Methodik, die nicht nur die zeitliche und räumliche Auflösung besitzt, den Ablauf einzelner Ereignisse mitzuverfolgen, sondern auch gleichzeitig Konformationsänderungen zu erfassen.Das beantragte Gerät wird in der Lage sein, einzelne mit verschiedenen Fluorophoren markierte Moleküle mit einer Auflösung im Millisekundenbereich zu verfolgen und zeitaufgelöste dynamische Messungen molekularer Konformationen über smFRET durchzuführen. Eine EMCCD Kamera für die lichtempfindliche Messung der Fluoreszenzsignale von smFRET Experimenten und empfindlichen biologischen Proben wird ergänzt durch eine sCMOS Kamera für die Erfassung eines vierfach größeren Bereichs bei gleicher Auflösung, falls die Photonenausbaute (>20 Photonen/Bildpunkt) dies erlaubt. Eine motorisierte TIRF Einheit ermöglicht den Wechsel zwischen TIRF und HILO (highly inclined and laminated optical sheet) Belichtung einzelner Laser Linien, um die Tiefe der Lichtanregung abzustimmen. Ein temperatur-kontrolliertes Gehäuse ermöglicht die Bildgebung bei Temperaturen, die auf unterschiedliche Modellsysteme, inklusive menschlicher Zelllinien, abgestimmt sind.
DFG-Verfahren
Forschungsgroßgeräte
Großgeräte
TIRF Mikroskop für Einzelmolekül-FRET Anwendungen
Gerätegruppe
5090 Spezialmikroskope
Antragstellende Institution
Julius-Maximilians-Universität Würzburg
