Festkörper-NMR für strukturelle Untersuchungen von in Infektionen involvierten bakteriellen RNAs

• Antragsteller: Dr. Alexander Marchanka
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 510696305

In diesem Forschungsprojekt wollen wir ein neues, integratives Festkörper-NMR-basiertes Verfahren entwickeln, um große RNA-Moleküle in Protein-RNA Komplexen in bakteriellen Infektionen zu untersuchen und dann mittels dieses Verfahrens die molekularen Prozesse zu verstehen, wie regulatorische RNAs zusammen mit dem weit verbreiteten RNA Chaperon Hfq die Genexpression in bakteriellen Infektionen regulieren.Große RNA-Moleküle sind sowohl für die Röntgenkristallographie als auch für die Elektronenmikroskopie anspruchsvolle Objekte, da RNAs sehr flexibel sind. NMR-Experimente in Lösung sind methodenbedingt im Bereich höherer Molekulargewichte limitiert und sind für die Strukturaufklärung von RNA-Molekülen, die länger als 100 Nukleotide sind, ungeeignet. Festkörper-NMR hingegen ist eine moderne Methode der Strukturbiologie für die Untersuchung von großen biomolekularen Maschinen und kann eine atomare Auflösung solcher Strukturen liefern. Wir schlagen einen Festkörper-NMR basierten Ansatz für die strukturelle Charakterisierung von RNAs vor, der auf der Kombination von Segment- und Nukleotid-Typ-spezifischen Markierungen, sowie einer Vielzahl von 13C- und 1H-Detektions-basierten NMR-Experimenten aufbaut. Zusätzlich werden die ergänzende Methoden der magnetischen Resonanz, wie paramagnetische Relaxationsverstärkung (PRE) Festkörper-NMR und Elektron-Spin-Resonanz (EPR)-Spektroskopie, angewendet.Aufbauend auf der methodologischen Kompetenz, die in dieser Projektphase gewonnen wurde, werden wir die Einzelheiten der Genregulierung durch regulatorische RNAs in bakteriellen Infektionen untersuchen. Die Funktion von vielen regulatorischen kleinen bakteriellen RNAs (sRNAs) ist von dem RNA Chaperon Hfq abhängig. Das Hfq Protein ist hochkonserviert in Bakterien und beinhaltet eine Innendomäne, die sich zu einem stabilen hexamerischen Ring mit mehreren Bindungsstellen für RNA vereinigt. Alle diese Bindungsstellen sind für eine effektive sRNA-Bindung essentiell. Außerdem bindet Hfq gleichzeitig an sRNAs und mRNAs, wodurch diese stabilisiert werden und deren Bildung von Basenpaaren unterstützt wird. Während mehrere kristallographische Strukturen von Hfq allein oder in Komplex mit einzelnen Nukleotiden oder kurzen Nukleotidsequenzen existieren, wurde soweit nur eine einzige atomare Struktur von Hfq in Komplex mit sRNA erhalten und der exakte molekulare Mechanismus von Hfq-vermittelten sRNA-mRNA Wechselwirkungen bleibt weiterhin unklar. Der Festkörper-NMR basierte Ansatz könnte also ein perfektes Werkzeug sein, um wichtige strukturelle und dynamische Informationen von binären Hfq-sRNA und tertiären mRNA-Hfq-sRNA Komplexen mit atomarer Auflösung zu erhalten.Unser neuer Ansatz bietet die einzigartige Gelegenheit, große bakterielle RNA-Moleküle und sogar deren hochmolekularen Komplexe in nativ-ähnlichen Bedingungen zu untersuchen. Die in diesem Projekt entwickelten Methoden können strukturelle Untersuchungen von vielen anderen infektiösen RNAs ermögliche

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