Strukture and function of plant and mammalian chromosomes: High resolution scanning electron microscopic structural analysis and localization of DNA and proteins with heavy metal staining and immunogold labeling
Final Report Abstract
Hochauflösende, analytische Rasterelektronenmikroskopie (REM) wurde zur Untersuchung der Ultrastruktur isolierter Chromosomen, zur hochauflösenden Analyse chromosomaler Substrukturen und funktioneller Domänen, insbesondere von NORs (nucleolus organizing regions) und von Centromeren eingesetzt. Zur Untersuchung der morphologischen Vielfalt von Chromosomen wurden Chromosomen von 24 Organismen aus dem Tier- und Pflanzenreich ausgewählt. Von den meisten Pflanzen konnten mit der etablierten Tropf/Kryo Methode vollständige Chromsomensätze isoliert werden. Chromosomen von Vertebraten lassen sich dagegen nur in Ausnahmefällen isolieren. Hochauflösende Untersuchungen sind in der Routine bis zu einer Auflösung von 10 nm-Strukturen möglich. Ungeachtet der Variation der Morphologie ist die substrukturelle Zusammensetzung der bisher untersuchten Chromosomen sehr einheitlich. Chromosomale Substrukturen bestehen aus 30 nm Fibrillen unterschiedlichen DNA-Gehalts, die in unkondensiertem oder aufgelockertem Chromatin sichtbar sind. In kondensierten Zuständen ist Chromatin in dichten Chromomeren verpackt. Primäre bzw. sekundäre Einschnürungen sind charakterisiert durch parallele Fibrillen und eine geringere Anzahl von (meist kleineren) Chromomeren. Technische Weiterentwicklungen ermöglichten Chromosomenanalyse mit hochauflösender REM. Schwerpunkt wurde gelegt auf: • Präparative Methoden zu Isolierung mit verschieden fixierter Chromosomen, • Versuche zur in situ Darstellung von Chromosomen, • Metallkontrastierung von DNA und Proteinen, • Analyse von Chromosomen ohne Metallbeschichtung, • FluoroNanogold Markierung von spezifischen DNA Seuqenzen und Proteinen für korrelative Fluoreszenz Lichtmikroskopie und REM, • Tomographie an Chromosomen mit fokussierten Ionenstrahl (FIB)/REM zur 3D Rekonstruktion chromosomaler Ultrastruktur und Signal-Verteilung. Bei der Analyse von Strukturvarianten und funktionellen Domänen wurde der Fokus auf Centromere und NORs (nucleolus organizing regions) gelegt: • NORs in Oziroë spec. und Melampodium longipilum weisen lange terminale bzw. interstitiale Strukturen auf; rDNA ist sowohl an diese Strukturen als auch an angrenzendem Chromatin lokalisiert. • Holocentrische Luzula spec. Chromosomen haben keine Centromer-Einschnürungen, aber weisen Chromomere und parallele Fibrillen über die Länge der Chromosomen auf. • Luzula elegans ist eine Ausnahme, und weist bilaterale Furchen auf, in der das centromer-spezifische Histon H3-Variant (CENH3) lokalisiert ist. • Lange Centromere in Macropus(Wallaby)-Chromosomen weisen kleine Chromomere auf, und beinhalten amplifizierte DNS satellite repeats und transposable elements. • Erbsen(Pisum sativum) Chromosomen weisen „meta-polycentrische“ Centromere auf mit ungewöhnlich langen primären Einschnürungen und multiplen CENH3 Domänen . • Hochauflösende 3D Tomographie von Gerstenchromosomen zeigt, dass CENH3 sowohl in zwei konzentrierten Domänen im Inneren der Centromere lokalisiert ist, als auch in angrenzenden perizentrischen Chromatin verteilt ist.
Publications
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