Strukture and function of plant and mammalian chromosomes: High resolution scanning electron microscopic structural analysis and localization of DNA and proteins with heavy metal staining and immunogold labeling
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Hochauflösende, analytische Rasterelektronenmikroskopie (REM) wurde zur Untersuchung der Ultrastruktur isolierter Chromosomen, zur hochauflösenden Analyse chromosomaler Substrukturen und funktioneller Domänen, insbesondere von NORs (nucleolus organizing regions) und von Centromeren eingesetzt. Zur Untersuchung der morphologischen Vielfalt von Chromosomen wurden Chromosomen von 24 Organismen aus dem Tier- und Pflanzenreich ausgewählt. Von den meisten Pflanzen konnten mit der etablierten Tropf/Kryo Methode vollständige Chromsomensätze isoliert werden. Chromosomen von Vertebraten lassen sich dagegen nur in Ausnahmefällen isolieren. Hochauflösende Untersuchungen sind in der Routine bis zu einer Auflösung von 10 nm-Strukturen möglich. Ungeachtet der Variation der Morphologie ist die substrukturelle Zusammensetzung der bisher untersuchten Chromosomen sehr einheitlich. Chromosomale Substrukturen bestehen aus 30 nm Fibrillen unterschiedlichen DNA-Gehalts, die in unkondensiertem oder aufgelockertem Chromatin sichtbar sind. In kondensierten Zuständen ist Chromatin in dichten Chromomeren verpackt. Primäre bzw. sekundäre Einschnürungen sind charakterisiert durch parallele Fibrillen und eine geringere Anzahl von (meist kleineren) Chromomeren. Technische Weiterentwicklungen ermöglichten Chromosomenanalyse mit hochauflösender REM. Schwerpunkt wurde gelegt auf: • Präparative Methoden zu Isolierung mit verschieden fixierter Chromosomen, • Versuche zur in situ Darstellung von Chromosomen, • Metallkontrastierung von DNA und Proteinen, • Analyse von Chromosomen ohne Metallbeschichtung, • FluoroNanogold Markierung von spezifischen DNA Seuqenzen und Proteinen für korrelative Fluoreszenz Lichtmikroskopie und REM, • Tomographie an Chromosomen mit fokussierten Ionenstrahl (FIB)/REM zur 3D Rekonstruktion chromosomaler Ultrastruktur und Signal-Verteilung. Bei der Analyse von Strukturvarianten und funktionellen Domänen wurde der Fokus auf Centromere und NORs (nucleolus organizing regions) gelegt: • NORs in Oziroë spec. und Melampodium longipilum weisen lange terminale bzw. interstitiale Strukturen auf; rDNA ist sowohl an diese Strukturen als auch an angrenzendem Chromatin lokalisiert. • Holocentrische Luzula spec. Chromosomen haben keine Centromer-Einschnürungen, aber weisen Chromomere und parallele Fibrillen über die Länge der Chromosomen auf. • Luzula elegans ist eine Ausnahme, und weist bilaterale Furchen auf, in der das centromer-spezifische Histon H3-Variant (CENH3) lokalisiert ist. • Lange Centromere in Macropus(Wallaby)-Chromosomen weisen kleine Chromomere auf, und beinhalten amplifizierte DNS satellite repeats und transposable elements. • Erbsen(Pisum sativum) Chromosomen weisen „meta-polycentrische“ Centromere auf mit ungewöhnlich langen primären Einschnürungen und multiplen CENH3 Domänen . • Hochauflösende 3D Tomographie von Gerstenchromosomen zeigt, dass CENH3 sowohl in zwei konzentrierten Domänen im Inneren der Centromere lokalisiert ist, als auch in angrenzenden perizentrischen Chromatin verteilt ist.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2007) Genomic instability within centromeres of interspecific marsupial hybrids. Genetics 177(4): 2507-2517
Metcalfe J, Bulazel K, Ferreri GC, Schroeder-Reiter E, Wanner G, Rens W, Obergfell C, Eldridge MDB, O'Neill RJ
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(2008) Scanning electron microscopy of chromosomes. In "Introduction to Electron Microscopy for Biologists", ed. Terry Allen. Methods in Cell Biology 88: 451-474
Wanner G, Schroeder-Reiter E
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(2009) Chromosome Centromeres: Structural and Analytical Investigations with High Resolution Scanning Electron Microscopy in Combination with Focused Ion Beam Milling. Cytogenet Gen Res 124: 239-250
Schroeder-Reiter, E. and Wanner, G.
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(2009). Focused ion beam (FIB) combined with high resolution scanning electron microscopy: A promising tool for 3D analysis of chromosome architecture. J Struct Biol. 165 (2): 97-106
Schroeder-Reiter, E., Pérez-Willard, F., Zeile, U., Wanner, G.
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(2011) Holocentric chromsomes of Luzula elegans are characterized by a longitudinal centromere groove, chromosome bending and a terminal nucleolus organizer region. Cytogenet Gen Res 134: 220-228
Heckmann, S., Schroeder-Reiter, E., Kumke, K., Ma, L., Nagaki, K., Murata, M., Wanner, G. and Houben, A.
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(2012) Current SEM techniques for de- and re-construction of centromeres to determine 3D CENH3 distribution in barley mitotic chromosomes. J Microscopy 246 (1) 96-106
Schroeder-Reiter, E., Sanei, M., Houben, A. and Wanner, G.
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(2012) Stretching the rules: monocentric chromosomes with multiple centromere domains. PloS Genetics 8(6): e1002777
Neumann, P., Navrátilová, A., Koblízková, A., Chocholová, E. Novaák, P., Schroeder- Reiter, E., Wanner, G. and Macas, J.
