Untersuchung einer universellen Stressantwort der Muskeln auf mechanische Belastung: CARP induziertes cross-linking von Titin-/Aktin-Filamenten im Sarkomer

• Antragstellerin: Jennifer Fleming, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 507930106

Das Sarkomer ist die kontraktile Einheit des quergestreiften Skelett- und Herzmuskels. Zahlreiche Stressfaktoren wie mechanische Überlastung, Stoffwechselstress und chronische Krankheiten führen zu einer adaptiven Regulierung der mechanischen Leistungsfähigkeit. Bei der quergestreiften Muskulatur wirkt CARP als ein universeller Stressreaktionsfaktor, das bei einer Gewebeverletzung CARP schnell und wirksam hochreguliert. Es zielt auf das Sarkomer ab, wobei es mit dem N2A-Element des Titin-Myofilaments im I-Band interagiert. Erst vor kurzem (2021) hat unser Labor gezeigt, dass die Ausrichtung des Sarkomers durch CARP die Vernetzung der Titin- und Aktinfilamente bewirkt und dass dies die Steifigkeit der Myofibrillen durch die Verkürzung der effektiven Länge der Federbereiche des Titins erhöht. Wir kamen zu dem Schluss, dass CARP ein Regulator der Sarkomermechanik ist, der die Muskeln in den frühen Stadien einer Gewebeverletzung schnell vor mechanischer Überlastung schützt und so die Skelettmuskeln vor Verletzungen bewahrt und damit auch die Schlagkraft des Herzens erhält. In diesem Projekt möchte ich die CARP/Titin/F-Aktin-Interaktion und ihre Regulierungsmechanismen auf molekularer Ebene charakterisieren, indem ich sowohl strukturbestimmende physikalische als auch biochemische Methoden anwende. Insbesondere werde ich auf die verfügbaren Materialien, Protokolle und vorläufigen Daten aufbauen, um die 3D-Struktur des CARP/Titin-N2A-Komplexes mit Hilfe der Röntgenkristallographie und die 3D-Struktur der CARP/Titin-N2A/F-Actin-Anordnung mit Hilfe der Kryo-Elektronenmikroskopie aufzuklären. Die Strukturen werden zum Verständnis der Wirkungsweise dieser Vernetzung im Sarkomer beitragen und die Identifizierung kritischer Schnittstellenreste ermöglichen. Letzteres wird die künftige Entwicklung von Zellsonden ermöglichen, die dazu führen können, die Funktionswege von CARP in der Myofibrille zu entschlüsseln und den biomedizinischen Nutzen ihrer Manipulation zu klären. Darauf hin will ich herausfinden, wie der CARP-Reaktionsmechanismus durch die Anwesenheit des konstitutiv exprimierten, konservierten Familienmitglieds MARP in der Zelle beeinflusst wird, das ebenfalls sarkomerisches Titin-N2A bindet. Schließlich werde ich die Regulierung der sarkomerischen Ausrichtung von CARP durch die posttranslationalen Modifikationen der Phosphorylierung, Ubiquitinierung und Methylierung mit Hilfe von Myoblasten-Kotransfektionen, in-vitro-Enzymimmunoassays (ELISA) zur Überwachung von Proteininteraktionen, enzymatischen Assays und Aktin-Co-Sedimentation untersuchen. Der Schwerpunkt wird darin liegen, herauszufinden, ob die zytosolische Methylierung und Ubiquitinierung an N2A die Lebensdauer von CARP im Sarkomer gegenreguliert. Insgesamt wird die Untersuchung dieses neu entdeckten regulatorischen Elements zum Verständnis seiner Funktion bei der Stressanpassung der Muskeln und seiner Verbindung zu klinisch-pathologischen Ergebnissen beisteuern.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen