Nup50 Funktion beim Kerntransport

• Antragsteller: Dr. Guillaume Holzer
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie ; Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 507747856

Kernporenkomplexe (NPCs) kontrollieren den Durchgang von Makromolekülen zwischen dem Zellkern und dem Zytoplasma. NPCs bestehen aus etwa 30 Proteinen, Nukleoporinen oder Nups, die in vielen Kopien pro NPC vorkommen, was NPCs zu den größten Proteinkomplexe der Zelle macht. Der Kerntransport ist für die zelluläre Homöostase von entscheidender Bedeutung, und NPC Fehlfunktionen werden mit einer Reihe von Krankheiten wie Krebs oder neurologischen Störungen in Verbindung gebracht.In einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung habe ich gezeigt, dass Nup50 für den NPC Aufbau erforderlich ist. Überraschenderweise ist die Lokalisierung von Nup50 am NPC für diese Funktion nicht notwendig, sondern eine neu beschriebene Interaktion mit RCC1, dem Guaninnucleotid-Austauschfaktor (GEF) für Ran, und dessen Stimulation.Die GEF-Aktivität von RCC1 ist wichtig für den Kerntransport, und Nup50 interagiert mit weiteren Kernimportfaktoren (Importine, Ran). Hier werde ich die Rolle von Nup50 beim Kerntransport untersuchen und dabei drei Punkte adressieren: I) Trägt die durch Nup50 vermittelte Erhöhung der RCC1-GEF-Aktivität zum Kerntransport bei? II) Unterstützt die Ran-Bindung von Nup50 den Kerntransport? III) Erhöht die Nup50-Lokalisierung an der Kernseite von NPCs die Effizienz des Kerntransports? Hierzu werde ich das Nup50/RCC1/Importin α/RanGTP-Interaktionsnetzwerk charakterisieren. Können diese Proteine einen tetrameren Komplex bilden? Wenn nicht, welche Assoziationen sind möglich, welche schließen sich gegenseitig aus? Dann werde ich in Zusammenarbeit mit Prof. Thomas Schwartz (MIT, Cambridge, USA) die Struktur des Nup50/RCC1-Dimers und im Idealfall des tetrameren Komplexes bestimmen. Als nächstes werde ich die Rolle des Nup50-Interaktionsnetzwerks beim Kernproteinimport untersuchen. Dazu werde ich Xenopus-Eiextrakte verwenden, in denen Kerne in vitro zusammengesetzt werden können, und von der hohen Flexibilität dieses zellfreien Systems profitieren: NPCs, die mit Nup50-Versionen gebildet werden, die in ihren verschiedenen Funktionen (RCC1-, Importin α- oder Ran-Bindung, NPC-Lokalisierung) defekt sind, werden auf ihre Kernimportfähigkeit hin untersucht. Die Ergebnisse aus dem zellfreien Assay werden in Zellen validiert, indem endogenes Nup50 durch relevante Nup50-Mutanten ersetzt und die Effizienz des Kernimports quantitativ analysiert wird. Schließlich werde ich das nukleäre und zytoplasmatische Proteinprofil von Wildtyp- und Nup50-Knockdown-Zellen vergleichen, um zu untersuchen, welche Proteine in ihrer Lokalisierung am stärksten von der Nup50-Fehlfunktion betroffen sind. Dieses Projekt wird die Rolle von Nup50 und seinen interagierenden Partnern im Kerntransport untersuchen, grundlegend für das Verständnis dieser Funktion für die zelluläre Homöostase und bei Pathologien. Auch die Rolle von Nup50 bei anderen zellulären Prozessen wie der Kontrolle des Zellzyklus oder der DNA-Reparatur führen, könnte so besser verstanden werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen