An der Schnittstelle von DNA-Replikation und Genomintegrität: Funktionelle Charakterisierung der replikativen Helikase MCM2-7 während S-Phase und Replikationsstress.

• Antragsteller: Dr. Luitpold Maximilian Reuter
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 505087959

DNA-Replikation ist ein essentieller Prozess aller lebender Organismen und stellt, wenn falsch reguliert, eine Hauptursache für genomische Instabilität und Krebs dar. Der MCM2-7-Komplex ist eine ringförmige Helikase, die in der G1-Phase des Zellzyklus auf DNA geladen wird und inaktiv bleibt, bis sich die Zelle zur Replikation entschließt. Daraufhin wird MCM2-7 aktiviert und in den CMG-Komplex (Cdc45-MCM2-7-GINS) transformiert. Nach Ausschluss eines einzelnen DNA-Stranges aus seinem Kern trennt MCM2-7 doppelsträngige DNA (dsDNA) an der Spitze der Replikationsgabel auf und stellt einzelsträngige DNA (ssDNA) als Matrize für die DNA-abhängigen DNA-Polymerasen bereit. Wie MCM2-7 auf dsDNA geladen und an den Replikationsursprüngen aktiviert wird wurde umfassend untersucht sowie der basale Replikationsprozess mit gereinigten Proteinen rekonstituiert. Jedoch ist überraschend wenig über die molekularen Mechanismen bekannt, die es der Replikationsmaschinerie ermöglichen, genomische Stabilität zu bewahren, wenn diese auf natürliche Hindernisse, DNA-Schäden oder Transkriptions-Replikationskonflikte stößt. Beispiele für solche Hindernisse sind Transkriptionsfaktoren und transkribierende RNA-Polymerasen, welche sperrige, DNA-gebundene Proteinkomplexe sind. Darüber hinaus können topologische Spannungen, wie z.B. R-loops, das Chromatin destabilisieren. Auch stellen DNA-Schäden, insbesondere Einzelstrangbrüche oder Quervernetzungen zwischen den DNA Strängen, eine große Herausforderung für die aktive Helikase dar.In all diesen Fällen muss der CMG-Komplex eine DNA-Hürde überwinden, aber die Mechanismen zur Umgehung sind nur unzureichend erforscht. Daher ist das Hauptziel dieses Vorhabens aufzudecken, wie die regulierte MCM2-7-Ringöffnung zur zuverlässigen Duplikation des Genoms beiträgt. Mittels genomweiten Analysen und einem chemisch-biologischen Ansatz zur Kontrolle der MCM2-7-Ringöffnung werde ich die nachstehenden Ziele verfolgen: 1.) Aufklärung des MCM2-7-Ringöffnungsmechnismus während der DNA Synthese in Abwesenheit und Gegenwart von DNA-Schäden und 2.) Charakterisierung von ssDNA und Mcm10, einem Protein zur Aktivierung der Replikation, in Transkriptions-Replikationskonflikten.Die Kombination von hochauflösenden Sequenzierungstechniken mit Proteomik wird die Definition von nativen, DNA-gebundenen Proteinkomplexen sowie deren Charakterisierung im Kontext der MCM2-7-Ringöffnung während der Replikation ermöglichen. Die vorgeschlagenen Arbeiten werden Faktoren identifizieren, welche die Helikase umbauen, die Chromatinlandschaft verändern oder RNA-Transkripte entfernen, um Replikationsstress mit direkter Relevanz für Krebs zu vermeiden. Da die Fehlregulation von MCM2-7 Komplexen bereits mit vielen Krebsarten in Verbindung gebracht wird, zielt dieses Vorhaben darauf ab, die Überschneidung von Replikations- und Transkriptionsereignissen systematisch mit einem neuen Blickwinkel auf die MCM2-7-Ringöffnung zu analysieren, um die Genomintegrität zu sichern.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen