Allosterische Kontollmechanismen von AAA+ Maschinen am Beispiel der zentralen bakteriellen ClpC/ClpP Protease

• Antragsteller: Privatdozent Dr. Axel Mogk
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 497321492

Hsp100 Chaperone sind ring-bildende, ATP-abhängige Maschinen, welche zentrale Komponenten von Proteinqualitätskontrollsystemen sind und wichtige Funktionen in bakterieller Physiologie und Virulenz haben. Sie üben eine mechanische Kraft aus, um Proteinsubstrate durch ihren zentralen Kanal zu transportieren und somit deren Disassemblierung bzw. Entfaltung zu bewirken. Viele Hsp100s (z.B. ClpC) assoziieren mit Peptidasen (z.B. ClpP) und bilden bakterielle Proteasomen. Deren proteolytsiche Aktivität kann für Zellen sehr gefährlich sein. Daher sind ATPase Aktivität und Substratselektion von Hsp100s streng kontrolliert. Diese Aktivitätskontrolle wird durch spezifische Partnerproteine (Adaptoren) ausgeübt, welche Substratspezifität vermitteln und die ATPase Aktivität von Hsp100s kontrollieren. Eine dauerhafte, Adaptor-unabhängige Aktivierung von Hsp100s ist extrem toxisch und stellt daher eine neuartige anti-bakterielle Strategie dar. Zum Mechanismus von Hsp100 Chaperonen sind viele zentrale Fragen noch ungeklärt. Wir wollen die ClpC/ClpP Protease des bedeutenden pathogenen Bakteriums Staphylococcus aureus als Modellsystem verwenden, um diese wichtigen mechanistischen Aspekte zu klären. ClpC besteht aus zwei hexameren ATPase Ringen und weiteren Domänen, welche die Bindung unterschiedlicher Adaptoren vermitteln. ClpC assoziiert mit der heptameren Peptidase ClpP um eine effektive ATP-getriebene Protease zu bilden. Wir möchten verstehen: Wie wird die Aktivität dieser Maschine durch die unterschiedlichen Adaptoren reguliert? Wie kooperiert die hexamere ClpC ATPase mit der heptameren ClpP Peptidase während Substratdegradation? Wie ist ATP Hydrolyse mit dem Transport von Substraten gekoppelt? Wir wollen diese Schlüsselfragen durch strukturbestimmende und biochemische Studien, sowie Einzelmolekülmessungen zur Bestimmung von Proteindynamiken beantworten. Die Ansätze beruhen auf den hoch komplementären Expertisen der beteiligten Partner: unserer enormen Erfahrung im Studium der Hsp100 Chaperone und der Expertise von Gilad Haran in der Anwendung von Einzelmolekül-FRET-Spektroskopie (smFRET) zum Studium der Dynamiken von molekularen Maschinen. Wie wollen (i) durch die Bestimmung von ClpC Cryo-EM Strukturen in diversen Aktivitätszuständen und deren Charakterisierung durch smFRET die diversen regulatorischen Prinzipien von ClpC definieren. Wir wollen weiterhin (ii) die Mechanik der ClpC/ClpP Protease durch direkte Beobachtung des Substrattransports und der relativen Bewegungen des ClpC Hexamers an der asymmetrischen ClpP-Interaktionsfläche während Substratdegradation analysieren. Das Projekt schließt (iii) mit der Anwendung der erzielten Erkenntnisse in der Suche nach kleinen Molekülen, welche die ClpC Aktivitätskontrolle ausschalten und zu einer dauerhaften, toxischen ClpC Aktivierung führen. Diese Aktivatoren stellen potentielle Antibiotika dar und verknüpfen die gewonnenen biochemischen und biophysikalischen Ergebnisse mit medizinischer Anwendung.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: Israel
• ausländischer Mitantragsteller: Professor Dr. Gilad Haran