Such nach Niedermolekularen zur Verbesserung der Effizienz und Spezifität des CRISPR-Cas9-vermittelten Genome Editing

• Antragsteller: Dr. Xinlai Cheng
• Fachliche Zuordnung: Pharmazie ; Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 491581972

Der Nobelpreis für Chemie 2020 wurde an Charpentier und Doudna für die Entwicklung von CRISPR-Cas9 verleiht; ein Meilenstein im Feld der Biotechnologie, der Gentherapie und des Genomediting. Jedoch ist die Anwendung dieses Systems größtenteils begrenzt durch ihre geringe Effizienz, besonders bei Primärzellen, induzierten pluripotenten Stammzellen und dem Off-Target-Effekt, verursacht durch unabsichtliches Editing. Wegen ihrer exzellenten Pharmakokinetik und Pharmakodynamik, hat eine Anzahl kleinerer Moleküle gezeigt, dass es die Aktivität und Spezifität des CRISPRCas9-Systems verbessern kann. Die meisten von ihnen beeinflussen CRISPR-Cas9 auf indirektem Wege, was zu einer geringeren Aktivität und Effizienz in bestimmten Zelltypen führt. Zur Bestimmung geeigneter kleiner Moleküle, welche direkt interagieren und dadurch die Cas9-Funktion und Aktivität beeinflussen, haben wir einen fluoreszenzbasierten Ansatz für ein chemisches High-Content- Screening durchgeführt. Dadurch haben wir Valporinsäure (VPA) als ein Cas9-Destabilisierer identifiziert, aufgelistet in einer chemischen Bibliothek, welche aus Hunderten von wirkstoffartigen Medikamenten besteht. Wir konnten aufzeigen, dass VPA die Cas9-Stabilität durch direkte Wechselwirkung in-vitro reduziert, und als Konsequenz, das CRISPR-Cas9-Genom-Editing bei Zellen im Zustand der Hyperthermie unterdrückt, ein Effekt der unabhängig vom inhibitorischen Effekt gegen Histon-Deacetylasen stattfindet. In Kombination mit der Bestrahlung des phototermalen Wirkstoffs Indocyaningrün mit einem Nahinfrarot-Laser und durch Erhitzen mit einem externen Wärmekissen, haben wir eine vorübergehende, kontrollierbare hyperthermische Umgebung erschaffen, der zum selektiven Abbau und Unterdrückung des Cas9-Proteins an gewünschtem Stellen der Zellpopulation führt. Im vorgestellten Projekt wollen wir die Untersuchung das Bindungsmodell des VPA-Cas9-Komplexes weiter fortführen. Darüber hinaus haben wir mit unserem Screening 32 Treffer in vier Clustern gefunden, die entsprechend ihrer chemischen Struktur robuste Bindungsaffinitäten in-vitro gezeigt haben. Wir beabsichtigen zur exklusiven Untersuchung der Aktivitäten und Funktionen der Kandidaten in cluster 1 and 2 in-vitro, in Zellen, und in Drosophila. Kokristall Strukturen von Cas9 mit individuellen Wirkstoffen und chemischer Optimierung werden unabhängig complementär durchgeführt. Zusammengefasst, werden wir nicht nur geeignete Wirkstoffe als neue Cas9-Modulatoren finden, aber auch umfassende Erkenntnisse vom des Wirkstoff-Cas9-Bindungs-Profil untersuchen, welche die Umsetzung vom CRISPR-Cas9-System erleichtert.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen