HPLC-MS/MS-Triple-Quadrupol-Massenspektrometer
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Arbeitsgruppe bearbeitet vorwiegend medizinisch-chemisch Projekte auf dem Gebiet diverser Neurotransmittertransporter, z.B. GABA-Transporter (GAT1-4), Serotonin-Transporter (SERT), Noradrenalin-Transporter (MET) oder Dopamin-Transporter (DAT). Die Aktivitäten der Gruppe umfassen die Erschließung von Struktur-Aktivitätsbeziehungen, die Entwicklung neuer Wirkstoffe, das Erstellen Computer-gestützter Modelle sowie das Etablieren MS-basierter assays für die betreffenden Targets. Verglichen mit der Situation vor der Bewilligung des (hier erfassten) HBFG-Antrags, in der uns nur ein vergleichsweise wenig leistungsfähiges LC-MS/MS System zur Verfügung stand, haben MS basierte Testsysteme mit der Beschaffung des neuen MS-Gerätes stark an Bedeutung gewonnen d.h. bereits etablierte Testsysteme wurden weiterentwickelt und neue etabliert. Dabei sei erwähnt, dass es durch Einsatz der MS-basierten Testsysteme zunehmend gelingt, auf den Einsatz von Radioliganden zu verzichten. Konkret wurden bzw. werden mit dem neuen Gerät folgende Projekte realisiert: • Untersuchung von SAR an GAT1: Die für GAT1 entwickelten MS-Bindungsassays werden inzwischen als Routinetestsystem für zahlreiche GAT1 SAR-Projekte eingesetzt. Aufgrund des hohen Probenaufkommens wird dazu auch das bewilligte LC-MS/MS-System genutzt. Aus diesen umfangreichen Arbeiten resultieren Ergebnisse, die wesentliche Informationen zu Publikationen der Arbeitsgruppe sowie für entsprechende Kooperationen zum Thema SAR an GAT1 beitragen. Das betreffende Testsystem konnte des weiteren so modifiziert werden, dass ein in-situ-screening Hydrazon- und Oximbasierter Bibliotheken ermöglicht wird. • Erhöhung von Durchsatz und Empfindlichkeit von GAT1 MS-Bindungsassays: Die Leistungsfähigkeit und damit die Akzeptanz sowie zukünftige Einsatzmöglichkeiten MS-basierter Bindungsassays hängen entscheidend von der Geschwindigkeit (d.h. dem Durchsatz) entsprechender Testsysteme ab. Durch die gewonnene zusätzliche Kapazität und die höhere Leistungsfähigkeit des bewilligten LC-MS/MS-Systems konnte für das oben erwähnte Testsystem exemplarisch gezeigt werden, dass die für MS-Bindungsassays erforderliche Marker-Quantifizierung mittels sehr schneller Chromatographie (18s pro Probe) bzw. mittels MALDI-MS/MS ohne wesentlichen Empfindlichkeitsverlust deutlich beschleunigt werden kann. • SERT MS-Bindungsassays: Für den Sertonin-Transporter, der für die Entwicklung neuer Wirkstoffe zur Therapie neuropathologischer bzw. psychiatrischer Erkrankungen (z.B. Depression) eine außerordentlich wichtige Bedeutung besitzt, wurde ein neuartiges Testsystem entwickelt, das die Charakterisierung der Bindung von nicht markiertem Fluoxetin zu hSERT in Sättigungs-, Kompetitions- und kinetischen assays ermöglicht. Es konnte gezeigt werden, dass die entwickelten MS-Bindungsassays entsprechende Radioligandbindungsstudien vollwertig ersetzen können. Um die für das Testsystem erforderliche Empfindlichkeit zu erreichen, war der Einsatz des bewilligten LC-MS/MS-Systems unabdingbar. • DAT/NET MS-Bindungsassays: Auch die mit dem Serotonin-Transporter eng verwandten Transporter für Dopamin und Nordadrenalin sind für die Arzneistoffentwicklung von großem Interesse. Gegenwärtig werden Bindungsassays unter Verwendung eines nativen, nicht markierten Markers entwickelt, die per LC-ESI-MS/MS an dem bewilligten Gerät analysiert werden. • GAT4 MS-Bindungsassays: Ein anderes Projekt hat die Etablierung von MS-basierte Bindungsassays für mGAT4 in Analogie zu mGAT1 MS-Bindungsassays zum Ziel. Das Vorhaben ist von grundlegender Bedeutung, da bisher nur Testsysteme zur Charakterisierung der Aufnahme radioaktiv markierter Substrate für dieses pharmakologisch und therapeutische relevante Target (z.B. Epilepsie) existieren, nicht jedoch Bindungsassays, welche wesentlich einfacher auszuführen und zudem leistungsstärker sind. • Quantifizierung von GABA per LC-MS/MS in GABA uptake assays: Die Untersuchung von SAR an den verschiedenen GABA-Transportersubtypen ist bisher - abgesehen von Bindungsassays für mGAT1 (siehe oben) - ausschließlich in uptake assays auf der Basis von radioaktiv markiertem GABA möglich. Deshalb wird in einem aktuellen Projekt die Machbarkeit einer LC-MS/MS basierten Analytik zur Quantifizierung des GABA-Transports in stabil transfizierten HEK293-Zelllinien untersucht. Da dieser Ansatz außergewöhnliche Anforderungen an die Empfindlichkeit des LC-MS/MS-Systems stellt, ist der Einsatz des bewilligten Systems eine zwingende Voraussetzung für dieses Projekt.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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"MS binding assays - with MALDI towards high throughput". Chem. Med. Chem., 2009, 4, 1523-1528
G. Höfner, D. Merkel, K. T. Wanner
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"Using short columns to speed up LC-MS quantification in MS binding assay". J. Chromatogr. B, 2010, 878, 1356-1364
G. Höfner, K.T. Wanner
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"(S)- and (R)-Fluoxetine as Native Markers in MS Binding Assays Addressing the Serotonin Transporter". ChemMedChem
M. Hess, G. Höfner, K.T. Wanner
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"Development and - validation of a rapid LC-ESI-MS/MS method for quantification of fluoxetine and its application to binding assays". Anal. Bioanal. Chem, 2011, 400, 3505-3515
M. Hess, G. Höfner, K.T. Wanner
