Molekulare Mechanismen der in vivo Regulation der Channelrhodopsine in Chlamydomonas reinhardtii

• Antragsteller: Professor Georg Kreimer
• Fachliche Zuordnung: Biochemie und Biophysik der Pflanzen
• Förderung: Förderung von 2021 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 468480235

In der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii sind Channnelrhodopsin 1 (ChR1) und ChR2 die dominanten an der Phototaxis beteiligten Photorezeptoren. Trotz des in verschiedenen Expressionssystemen gewonnenen detaillierten Wissens über ihre Struktur und Eigenschaften ist bisher nur wenig über ihre Regulation und die von ihnen initiierte Signalkaskade in Chlamydomonas bekannt. Ein wichtiger Prozess bei der Anpassung der phototaktischen Sensitivität an verschiedene physiologische Bedingungen ist eine reversible Phosphorylierung des ChR1, die über eine Ca2+-basierte Feed-back-Regulation gesteuert wird. Daneben unterliegt ihr Transkript-Gehalt einer Licht-abhängigen Kontrolle. Diurnale Transkriptions-Analysen zeigen einen extremen Abfall der ChR-Transkript-Level in der ersten Stunde nach Tagesbeginn. Auch der Protein-Gehalt zeigt einen parallelen von Lichtfarbe und Intensität abhängigen starken Rückgang. Die bisherigen Daten deuten auf ein Netzwerk von Blaulicht-Rezeptoren bei dieser Regulation hin. Knock-out-Mutanten von Phototropin (Phot) belegen dessen zentrale Rolle bei der Kontrolle des ChR1-Gehalts. Der ChR2-Abbau ist jedoch in den Phot-Mutanten normal. Daneben gibt es aber auch beim ChR1-Abbau Phot-unabhängige Komponenten. In diesem Projekt wollen wir dieses Netzwerk, das den ChR-Gehalt Licht-abhängig kontrolliert, weiter charakterisieren. Dazu werden über CRISPR/Cas9-erzeugte weitere Blaulicht/UV-Photorezeptor-Deletionsstämme (inkl. Doppel-Mutanten) eingesetzt. Zusätzlich beziehen wir Mutanten zentraler Regulatoren Licht-abhängiger Reaktionen in die Analysen ein. Interessanterweise unterscheiden sich in Expressionssystemen festgestellte wichtige ChR-Eigenschaften, wie z.B. die Ca2+-Abhängigkeit, von den in Chlamydomonas gemessenen. Die Gründe hierfür sind unklar, könnten jedoch auf bisher unbekannte ChR-Interaktionen mit anderen Proteinen zurückzuführen sein. Exprimierte ChRs sind Homodimere. Unsere bisherigen Daten zeigen, dass in Chlamydomonas darüber hinaus auch bisher nicht näher charakterisierte spezifische hochmolekulare Komplexe (HMMCs) vorliegen. ChR-Komplex-Bildung mit anderen Proteinen wurde als eine Möglichkeit zur notwendigen Signalamplifikation bei niedrigen Lichtintensitäten postuliert, aber experimentell noch nicht gezeigt. Die HMMCs könnten sowohl diese als auch Proteine, die zu den geänderten ChR-Eigenschaften führen, beinhalten. Andererseits könnte eine Subgruppe der HMMCs auch mit dem ChR-Abbau zusammenhängen. Wir wollen daher diese HMMCs auftrennen, ihre Zusammensetzung über Massenspektrometrie klären sowie die Bedingungen, unter denen sie gebildet werden, näher charakterisieren. Durch dieses Projekt möchten wir einerseits dazu beitragen, die molekularen Mechanismen der Anpassung des ChRs-Gehalts an die jeweiligen Lichtbedingungen zu verstehen. Andererseits hoffen wir, durch die Analyse der HMMCs zum besseren Verständnis der Initiierung und Kontrolle der phototaktischen Orientierung durch die ChRs beizutragen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen