Neue duale rAAV-Vektoren für (Epi)Genom-basierende Therapie von Gain-of-Function-Mutationen

• Antragsteller: Dr. Elvir Becirovic
• Fachliche Zuordnung: Pharmakologie
• Förderung: Förderung von 2021 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 467202329

Rekombinante Adeno-assoziierte virale (rAAV)-Vektoren stellen derzeit den Goldstandard für die Gentherapie dar. Viele Gene übersteigen jedoch die begrenzte genomische DNA-Aufnahmekapazität dieser Vektoren. Dazu gehören auch verschiedene CRISPR/Cas-Module, die ein hohes therapeutisches Potenzial besitzen. Diese Module lassen sich prinzipiell jedoch trennen und können dann in separaten rAAV Vektoren verpackt und anschließend im Rahmen dualer rAAV Vektoren auf Genom-, mRNA- oder Proteinebene wieder vollständig rekonstituiert werden. Eine Rekonstitution auf Genom- oder Proteinebene ist bereits etabliert, birgt jedoch einige wichtige Nachteile, die das translationale Potential dieser Ansätze behindern. Im Vergleich dazu bleibt die Rekonstitution auf mRNA-Ebene mit Hilfe des mRNA Trans-Spleißens eine größtenteils unerforschte duale rAAV-Strategie, die entscheidende Vorteile bietet. In Vorversuchen haben wir einen mRNA Trans-Spleiß-Ansatz in vitro entwickelt und konnten zeigen, dass das Cas9-VPR Modul in der Netzhaut von Mäusen mit Hilfe von dualen rAAV Vektoren funktionell rekonstituiert werden kann. Dieses Modul kann genutzt werden, um einzelne Gene zu aktivieren oder um verschiedene Gene gleichzeitig auszuschalten bzw. zu aktivieren. Letztere Strategie ist mutationsunabhängig und würde es erlauben, derzeit nicht therapierbare Gain-of-Function Mutationen zu behandeln, bei denen die Gensupplementierung mit der Ausschaltung des mutierten Allels kombiniert werden muss.In diesem Antrag soll unsere neuartige mRNA Trans-Spleiß-Technologie zur Etablierung eines neuen Gentherapie-Ansatzes am Mausmodell für autosomal-dominante Retinitis Pigmentosa, die durch die häufigste Gain-of-Function Mutation in Rhodopsin (Pro23His) hervorgerufen wird, getestet werden. Zu diesem Zweck soll das Cas9-VPR Model verwendet werden, um eine gleichzeitige Ausschaltung des Stäbchen-spezifischen Rhodopsin-Gens und Aktivierung dessen Zapfen-spezifischer funktioneller Äquivalente M-opsin (Opn1mw) bzw. S-Opsin (Opn1sw) in der Netzhaut der Rho Pro23His Mäuse zu ermöglichen. In den nachfolgenden Versuchen soll der Therapieerfolg auf molekularer, morphologischer, funktioneller und verhaltensbiologischer Ebene getestet werden. Das translationale Potenzial dieses Ansatzes soll zusätzlich dazu in Zellkultur-Experimenten und in humanen Netzhaut-Organoiden getestet werden. Durch die Kombination zweier neuartiger Ansätze befasst sich dieser Antrag somit mit zwei immer noch ungelösten Kernproblemen im Bereich der Gentherapie: i) Mit der Entwicklung und experimentellen Validierung einer sicheren und effizienten Methode zur Rekonstitution großer Gene unter Verwendung dualer rAAV-Vektoren ii) Mit der Entwicklung und experimentellen Evaluierung einer neuen Strategie für die Gentherapie von derzeit nicht behandelbaren Gain-of-Function-Mutationen. Beide Ansätze weisen ein hohes Translationspotential auf, von dem viele Patienten weltweit profitieren könnten.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen