Dynamische Analyse der MALT1-Parakaspase-Aktivität durch fluoreszenzlöschende aktivitätsbasierte Sonden

• Antragstellerin: Dr. Michaela Prothiwa
• Fachliche Zuordnung: Biologische und Biomimetische Chemie
• Förderung: Förderung von 2020 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 454236790

Eine falsch regulierte Protease-Aktivität der MALT1-Parakaspase spielt bei verschiedenen Erkrankungen des Menschen eine große Rolle. Beispielsweise ist MALT1 in hochaggressiven Unterformen diffuser großzelliger B-Zell-Lymphome (DLBCL) konstitutiv aktiv. Klinische Studien mit MALT1-Inhibitoren laufen bereits, jedoch ist hierbei eine Stratifizierung der Patienten unerlässlich, um die Behandlungserfolge abschätzen zu können. Darüber hinaus wurde MALT1 kürzlich auch mit entzündlichen Darmerkrankungen assoziiert. In der vorliegenden Studie werde ich fluoreszenzlöschende aktivitätsbasierte Sonden (qABPs) als chemische Werkzeuge entwickeln, um die Proteaseaktivität von MALT1 mittels Durchflusszytometrie und Echtzeit-Bildgebung zu untersuchen. Das Design von MALT1-qABPs basiert dabei auf einem Acyloxymethylketon (AOMK) als reaktive Gruppe, welche für Cysteinproteasen selektiv ist. Zudem enthalten die qABPs ein Tetrapeptid mit einer spezifischen Sequenz, die sowohl für Selektivität als auch Zellpermeabilität entscheidend ist. Bei der Mechanismus-basierten Reaktion von AOMKs mit Cysteinproteasen wird die Acyloxygruppe abgespalten. Dies ermöglicht die Einführung einer fluoreszenz-löschenden Quencher-Gruppe, wodurch eine "intelligenten" Sonde entsteht, die selbst nicht fluoresziert, sondern erst nach der Reaktion mit seinem Ziel. Die neu gebildete kovalente Bindung zwischen der Sonde und MALT1 verhindert anschließend die Diffusion des resultierenden Fluoreszenzsignals und ermöglicht somit eine nachgeschaltete biochemische Analyse des gebundenen Proteins. Zur Optimierung der Durchflusszytometrie und der Echtzeit-Bildgebung werde ich verschiedene Fluorophor-Quencher-Paare entwickeln. Nach einer ersten biochemischen Validierung werden MALT1-qABPs in Studien für klinische Anwendungen eingesetzt, um Lymphom-Subtypen eindeutig zu klassifizieren. Zu diesem Zweck wird die durchflusszytometrische Anwendung der qABPs zuerst unter Verwendung von Zellkulturmodellen, und schließlich mit Zellen aus resezierten Lymphknoten von Patienten, die an Lymphomen leiden, optimiert werden. Dieses Material wird verwendet, um (1) den Aktivitätszustand von MALT1 zu quantifizieren und (2) die Wirksamkeit von MALT1-Inhibitoren zu überwachen. In einem separaten Arbeitspaket wird die Echtzeit-Bildgebung mit MALT1-qABPs demonstriert. Dabei wird die in Studien beschriebene Hochregulation von MALT1 im Darm während einer Kolitis analysiert. Insbesondere wird ein Mausmodell, das chemisch zur Entwicklung einer Kolitis induziert wurde, für die ex vivo und in vivo Fluoreszenzmikroskopie verwendet. Auf dieser Grundlage werde ich fundamentalen Forschungsfragen nachgehen, um die bisher unbekannten Rollen von MALT1 bei entzündlichen Darmerkrankungen zu beleuchten.

• DFG-Verfahren: WBP Stipendium
• Internationaler Bezug: Belgien
• Gastgeber: Professor Dr. Steven Verhelst