Intrazelluläre Prozessierung von Borrelia burgdorferi in humanen Makrophagen

• Antragsteller: Professor Dr. Stefan Linder
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2020 bis 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 452810684

In diesem Projekt untersuchen wir molekulare Mechanismen, die die intrazelluläre Prozessierung von Borrelien in primären humanen Makrophagen regulieren. Ein besonderer Fokus liegt dabei auf phagosomaler Kompaktierung und phagolysosomaler Reifung. Die Spirochäte Borrelia burgdorferi ist das kausale Agens der Lyme Borreliose, einer multisystemischen Erkrankung, die vor allem Haut, Gelenke und Nervensystem betrifft. Die erfolgreiche Eliminierung von Borrelien durch humane Immunzellen wie Makrophagen ist dabei für den Ausgang einer entsprechenden Infektion entscheidend. Unsere bisherigen Arbeiten identifizierten das Sorting Nexin SNX3 als zentrale Schaltstelle zwischen phagolysosomaler Reifung und Membran-Recycling in Makrophagen, SNX3 ermöglicht das Andocken von Rab5a-positiven Vesikeln an Phagosomen, durch Bindung von PI(3)P, und rekrutiert zudem weitere Vesikel, die positiv für Galectin-9 und Flotillin-2 sind. Das Zusammenwirken dieser Regulatoren führt zur Ausbildung und Abschnürung von Membran-Tubuli an Phagosomen und so zu phagosomaler Kompaktierung, einer Voraussetzung für phagolysosomale Reifung. Wir verfolgen nun einen zweigeteilten Ansatz, durch i) Untersuchung von identifizierten Regulatoren, sowie ii) einen unvoreingenommenen screen nach neuen Regulatoren. Das Arbeitsprogramm gliedert sich entsprechend in einen Kandidaten-Ansatz, in dem die molekulare Wirkungsweise und die räumliche und zeitliche Koordination identifizierter Regulatoren wie Galectin-9, Flotillin-2 und KIF16B untersucht werden, sowie einen Screening-Ansatz, basierend auf magnetischem labeling der Spirochäten und Isolierung Borrelien-haltiger Phagosomen, in Kombination mit stabiler Isotopen-Markierung von Zellen (SILAC) und Massenspektrometrie. Die Durchführbarkeit dieser Ansätze wurde erfolgreich getestet, und alle nötigen Techniken sind in unserem Labor oder dem Labor unseres Kollaborators etabliert. Zum Einsatz kommt eine Kombination von Techniken, so i) molekularbiologische Techniken wie Expression von Fusions- und mutierrten Proteinen, siRNA-basierter knockdown, Immunopräzipitation, GST-/MBP pull down, und Phosphoinositol-Bindungsassays, ii) mikroskopische Techniken wie live cell imaging und STED Hochauflösung, iii) Zell-basierte Assays wie phagosomale Kompaktierung, phagolysosomale Ansäuerung und Proteolyse, intrazelluläres Überleben von Borrelien, SILAC Labeling primärer Zellen und proximity ligation Assays, sowie iv), zusammen mit unserem Kollaborator Dr. Ludger Johannes (Institut Curie, Paris), Herstellung großer unilamellärer Vesikel (GUVs) und Membran-Tubulierungs Assays. Diese komplementären Ansätze werden nicht nur neue Daten zu phagosomaler Kompaktierung und phagolysosmaler Reifung von Borrelien liefern, sondern auch neue molekulare Mechanismen aufdecken, die den intrazellulären Transport von Phagosomen mit endosomalem Reycling verbinden und so generelle regulatorische Prinzipien der Prozessierung von Pathogenen in menschlichen Immunzellen enthüllen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen