Biogenesis, maturation and fusion of autophagosomes

• Antragsteller: Professor Dr. Christian Ungermann
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Strukturbiologie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 448135520

Die Autophagie ist von zentraler Bedeutung für den Stoffwechsel und die Qualitätskontrolle von Zellen, die auf die metabolischen Bedürfnisse der Zellen abgestimmt werden kann. Besonders deutlich wird dies bei Stickstoffmangel, wenn Zellen einen Teil ihres Zytosols und ihrer Organellen in neu gebildete Autophagosomen umschließen. Autophagosomen bilden sich de novo als Doppelmembranstruktur, die nach Schließen mit Vakuole verschmilzt. In diesem Projekt stehen hierzu folgende Fragen im Zentrum: (i) Wie wird die koordinierte Bildung des Phagophors erreicht (durch die Untersuchung des Zusammenspiels der Schlüsselproteine Atg2, Atg18 und Atg9)? Dies wird in Aim 1 behandelt. (ii) Wie kontrollieren die Lipidphosphatase Ymr1 und der Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor (GEF) Mon1-Ccz1 als Rab7/Ypt7-Aktivator die Schritte der Autophagosomenreifung und Membranfusion? Dies wird der Schwerpunkt von Aim 2 sein. In Aim 1 werden wir analysieren, wie der Lipidtransfer zur wachsenden Phagophore vermittelt und dieser Transport reguliert wird. Auf der Grundlage unserer Arbeiten zur in-vitro-Rekonstitution des Atg2-Atg18-vermittelten Lipidtransfers und des Atg9-abhängigen Lipid-Scramblings werden wir strukturelle Ansätze mittels Kryo-Elektronenmikroskopie mit funktionellen Analysen des Lipidtransfers und des Scramblings kombinieren, um das Zusammenspiel dieser drei Proteine und die Rolle von PI3P zu verstehen. Dazu gehört die vergleichende Analyse von Atg2 mit dem Atg2-Atg18-Komplex und die detaillierte Analyse der Atg2-Atg9-Schnittstelle, um kritische Reste zu identifizieren, die am Lipid-Gating beteiligt sind. Wir gehen davon aus, dass die Atg2-Bindung die Fähigkeit von Atg9 steuert, Lipide zu erkennen und zu verteilen, wodurch ein kontinuierlicher und effizienter Transfer von Lipiden gefördert wird. Wir werden weiter untersuchen, wie die Kinase Atg1 diesen Prozess kontrolliert, indem wir Phosphorylierungsstellen und ihre Rolle bei der Kontrolle der Aktivität der Proteine identifizieren. Alle relevanten Stellen werden durch in-vivo-Tests mit entsprechenden Mutanten analysiert, um die In-vitro-Ergebnisse zu validieren. In Aim 2 werden wir untersuchen, wie verschiedene Schlüsselproteine die Reifung und Fusion von Autophagosomen fördern. Im Mittelpunkt unserer Analyse stehen a) die Kontrolle des PI3P-Gehalts durch die Lipidphosphatase Ymr1 und b) der Mechanismus der Aktivierung des Mon1-Ccz1-Komplexes und sein Zusammenspiel mit Atg8 zur Rekrutierung von Ypt7 auf Autophagosomen. Für beide Teilprojekte wurden gereinigte Proteine und Assays zur Überwachung der jeweiligen Liganden entwickelt. Wir werden insbesondere die Rolle des Atg1-Kinase-Komplexes bei der Kontrolle von Ymr1 und Mon1-Ccz1 untersuchen. Jede aus einem Phosphoproteom-Screening abgeleitete Punktmutante, die ihre Aktivität kontrolliert, wird durch in-vivo-Autophagie-Assays validiert.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen