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Projekt
"cross kingdom exRNA Transfer" in dem Ustilago maydis/Mais Pathosystem
Antragsteller
Professor Dr. Michael Feldbrügge
Fachliche Zuordnung
Pflanzenzüchtung, Pflanzenpathologie
Förderung
Förderung seit 2020
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 433194101
Bei der Untersuchung des U. maydis/Mais-Pathosystems haben wir eine Reihe von ex-mRNAs in voller Länge identifiziert, die in EVs aus kultivierten infektiösen Hyphen angereichert wurden. Die mRNAs kodieren beispielsweise Enzyme, die an der Thiamin-Biosynthese beteiligt sind, wie Thi4, deren mRNA-Menge während der Infektion hochreguliert werden. Interessanterweise enthält Thi4 ein vorhergesagtes Chloroplasten-Zielsignal, was auf einen Transfer zu den Wirtsorganellen hindeutet, um den Pflanzenstoffwechsel während der Infektion umzuprogrammieren. Um dies zu überprüfen, haben wir ein fluoreszenzgestütztes Zellsortierverfahren zur Reinigung von Protoplasten aus infizierten Pflanzen ohne Pilzhyphen entwickelt. In Pilotversuchen wurden in den sortierten Protoplasten pilzliche Transkripte nachgewiesen. Derzeit erhöhen wir die Sequenzierungstiefe, um zuverlässige Kandidaten zu erhalten. In einem gezielteren Ansatz konnten wir nachweisen, dass Thi4 mRNA und das kodierte Protein in EVs vorhanden waren. Bei diesem Beispiel könnte es wichtig sein, mRNA- und Protein-Effektor gleichzeitig zu liefern, um eine perfekte räumlich-zeitliche Kontrolle zu erreichen. Schließlich haben wir das Syntaxin-SNARE-Protein Sso1 als generischen EV-Marker etabliert. Swollen wir in Zukunft ein zuverlässiges Proteininventar von EVs erstellen, zur Identifizierung von RBPs, die für die exRNA-Kommunikation über die Grenzen der einzelnen Organismen hinweg relevant sind. In der zweiten Förderperiode werden wir untersuchen, wie und warum mRNAs während der Infektion von U. maydis auf die Wirtspflanze Mais übertragen werden. Wir untersuchen dAuslieferung von ex-mRNAs über EVs als wichtige Transportvehikel. In Zusammenarbeit mit B2 Kehr werden wir Syntaxine als EV-Markerproteine einsetzen, um die EV-Aufreinigung zu optimieren, was zu qualitativ hochwertigen mRNA- und Proteinbeständen führt. Um Komponenten der EV-Reifungs- und Beladungsmaschinerie zu identifizieren, werden wir einen Kandidatengen-Ansatz verfolgen. Ähnlich wie bei A4 Weiberg untersuchen wir definierte Mutanten im Bereich des Membrantransports, die z.B. die Bildung von Endosomen oder multivesikulären Körpern beeinflussen. Die mögliche Beteiligung von RBPs wie Annexin werden wir zusammen mit B2 Kehr und B5 Meister untersuchen. Die potentielle Translation von Pilz-mRNAs in Pflanzen wird in Zusammenarbeit mit A2 Panstruga unter Verwendung von pflanzlichen in vitro Translationssystemen analysiert. Um die Translation während der Infektion nachzuweisen, werden wir in Zusammenarbeit mit B5 Meister und A5 Gutjahr TRAP-Seq-Experimente mit Antikörpern durchführen, die spezifisch für pflanzliche Ribosomen sind. Gendeletionsmutanten von translatierten Kandidaten-mRNAs werden Einblicke in die biologische Funktion der jeweiligen Translationsprodukte geben. Im Wesentlichen werden wir den Mechanismus des ex-mRNA-Transfers und seine funktionellen Konsequenzen aufklären und so den Weg für die Identifizierung neuer Fungizid-Zielmoleküle ebnen.
DFG-Verfahren
Forschungsgruppen
