In situ Struktur von Aktinpolymerisations- und Zelladhäsionsmaschinen mit Kryo-Elektronentomographie

• Antragstellerin: Dr. Marion Jasnin
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie ; Biophysik ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2020 bis 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 446059367

Aktinpolymerisation ist für die Aufrechterhaltung von Zellform und -integrität, die Etablierung von Zellpolarisation, sowie die Erfassung der mechanischen Mikroumgebung essentiell. Angetrieben durch Aktinpolymerisation schieben Lamellipodial- und Filopodialvorsprünge die Zellmembran nach vorne, während Podosome und Invadopodien Wege für die Zellmigration durch die dichte extrazelluläre Matrix schaffen. Strukturell ist wenig bekannt, wie die Komponenten der Aktinmaschinerie innerhalb der Zelle auf molekularer Ebene zusammenarbeiten und wie sie durch den Aufbau von Netzwerken Kräfte erzeugen.Das Aktin-Zytoskelett ist mit der Plasmamembran über das Integrinadhäsom, einem komplexen Netzwerk von Hunderten miteinander interagierenden Proteinen, verbunden. Da klassische strukturbiologische Methoden auf Proteinextraktion basieren oder die Morphologie verändern, ist strukturell nicht erforscht, wie diese Adhäsionsmoleküle die Zell-Matrix-Adhäsion regulieren.Innerhalb der Aktinstrukturen untersuchen wir die Architektur von Podosomen in humanen Makrophagen. Verzweigte Aktinnetzwerke und Adhäsionsmoleküle sind in diesen mechanosensitiven Strukturen eng gekoppelt und stellen ein ideales Werkzeug dar, um das Zusammenwirken beider Maschinen zu untersuchen. Podosome haben einen zentralen Kern aus Aktinfilamenten, umgeben von einem Ring aus Adhäsionsmolekülen, unter anderem Integrine, sowie Transducerproteine, welche die Integrine mit dem Aktin-Zytoskelett verbinden. Die vorgeschlagene Forschung nutzt technologische Fortschritte in der Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET), um die strukturellen Grundlagen entscheidender Aspekte der Funktion und Mechanik von Podosomen zu schaffen. Basierend auf unserer Expertise sowohl in Kryo-ET, als auch in der Mechanobiologie von Podosomen, beabsichtigen wir, folgendes innerhalb der intakten Zelle (in situ) zu erforschen:1- Die molekulare Architektur von Aktinfilamenten und deren Regulatoren, einschließlich Aktinverzweigungen und vernetzenden Molekülen, und die Aufklärung des molekularen Mechanismus, durch welchen Protrusionskräfte erzeugt und übertragen werden. 2- Die Zusammensetzung und Struktur eines Megadalton-Adhäsionskomplexes und seine Rolle innerhalb des Mechanosensing-Prozesses von Podosomen. Wir schlagen vor, Kryo-ET, Kraftmessungen im Nanobereich, quantitative 3D-Nanoskopie und Computermodelle zu kombinieren, um die Organisation der Aktinpolymerisations- und Adhäsionsmaschinen in Podosomen zu bestimmen und die Strukturmechanismen des zellulären Mechanosensing-Prozesses in situ aufzuklären. Die Ergebnisse werden es uns ermöglichen, die Kraft-ausübenden Komponenten zu bestimmen und hochauflösende Strukturen entscheidender Aktin- und Adhäsionsproteine zu erhalten, die mit keiner anderen strukturbiologischen Methode möglich sind.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: Frankreich
• Partnerorganisation: Agence Nationale de la Recherche / The French National Research Agency
• Kooperationspartner: Dr. Renaud Poincloux