Q-Band gepulstes EPR Spektrometer (Teilfinanzierung)

• Fachliche Zuordnung: Grundlagen der Biologie und Medizin
• Förderung: Förderung in 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 438280639

Unsere Gruppe untersucht die Struktur, Funktion und Dynamik einiger wichtiger Membranproteinkomplexe. Elektronenspinresonanz-Spektroskopie-Techniken, insbesondere gepulste Elektron-Elektron-Doppelresonanz, werden in unserer Forschung als das wichtigste biophysikalische Werkzeug verwendet. Experimente an Membranproteinen sind aus mehreren Gründen herausfordernd. Die niedrigen Expressionsniveaus führen oft zu kleinen Probenmengen. Die Phasengedächtniszeit der Spinmarker wird erheblich durch das gebundene Membranprotein verringert. Diese Einschränkungen führen mit der engen Anregungsbandbreite herkömmlicher rechteckiger Mikrowellenpulse zu einer schlechten Empfindlichkeit und erschweren die Messung größerer Entfernungen (> 5 nm) erheblich. In der Strukturbiologie von Membranproteinen spielt die native Lipidumgebung eine wichtige Rolle für die Proteinfaltung, -struktur und -funktion. Eines der Hauptziele unserer Arbeitsgruppe ist die Entwicklung und Anwendung von gepulste Elektronen-Elektronen Doppelresonanz zur Untersuchung von Membranproteinen in situ. Aus einigen zusätzlichen Gründen, wie der unspezifischen Spinmarkierung, der Instabilität der Spinmarkierungen und der geringen Proteinexpression usw., ist dies noch schwieriger. In den letzten Jahren hat die Verfügbarkeit eines gepulsten Hochleistungsspektrometers die Empfindlichkeit solcher Experimente mit Membranproteinen erheblich verbessert. Dieses Gerät ist mit einem Hochleistungs-Mikrowellenverstärker und einem Generator für beliebige Wellenformen ausgestattet, die zusammen Möglichkeiten für neuartige Untersuchungen an Membranproteinen bieten. Mit einem solchen Gerät möchten wir die Konformationsheterogenität und die Gleichgewichtsdynamik charakterisieren, die die Grundlage für die Funktion in Membrantransportproteinkomplexen bilden. Neue Ansätze mit unterschiedlichen Spinmarkern, Markierungsstrategien und Probenvorbereitungsprotokollen werden für die in situ Elektronenspinresonanzspektroskopie getestet. Diese Ansätze werden später verwendet, um die Proteinfaltung durch den β-Fass-Assemblierungsmaschinerie und das Lipopolysaccharid-Transportsystem von gramnegativen Bakterien zu untersuchen. Beide Systeme sind konserviert und essentielle gramnegative Bakterien. Daher sind sie sehr erwünschte Ziele für neuartige Antibiotika. Des Weiteren haben wir den Substrattranslokationsmechanismus für primäre und sekundäre aktive Membrantransporter untersucht. An dem ATP-Bindungskassetten-Exporter TmrAB konnten wir die Konformationsgleichgewichte in den drei funktionellen Domänen unabhängig voneinander beobachten. Mit dem protonengekoppelt Fumarat-Symporter SLC26Dg haben wir die Dimerstruktur in Proteoliposomen unter Verwendung gepulste Elektronen-Elektronen Doppelresonanzdaten modelliert. Wir wollen die Details der Protein-Substrat- und Protein-Lipid-Wechselwirkungen weiter untersuchen und die Änderungen der thermodynamischen Parameter während der Substrattranslokation in diesen Transportern untersuchen.

• DFG-Verfahren: Forschungsgroßgeräte
• Großgeräte: Q-Band gepulstes EPR Spektrometer (Teilfinanzierung)
• Gerätegruppe: 1770 Elektronenspinresonanz-Spektrometer (EPR, ESR)
• Antragstellende Institution: Goethe-Universität Frankfurt am Main
• Leiter: Benesh Joseph, Ph.D.