Erforschung der wenig untersuchten CRISPR-Cas Verteidigungs-Systeme I-B und I-D in Haloarchaea

• Antragstellerin: Professorin Dr. Anita Marchfelder
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 433108819

Obwohl das CRISPR-Cas Verteidigungssystem der Bakterien und Archaeen nun schon vor über 10 Jahren entdeckt worden ist, sind noch lange nicht alle molekularen Mechanismen dieser Immunabwehr aufgeklärt. Es gibt über 33 verschiedene Varianten des CRISPR-Cas Systems, die alle die Aufgabe der Verteidigung ausführen, dies aber mit unterschiedlichen Proteinen und molekularen Abläufen bewerkstelligen. Während wir über ein paar Varianten, wie zum Beispiel das CRISPR-Cas Typ I-E von E. coli und das Typ II-A von Streptococcus pyogenes, schon sehr viel wissen, gibt es andere Subtypen -wie z.B. die Typen I-B und I-D- über die recht wenig bekannt ist. Auch ist über bakterielle Systeme deutlich mehr bekannt als über archaeale, obwohl nur etwa die Hälfte aller Bakterien CRISPR-Cas Systeme haben aber fast alle Archaeen. In diesem Projekt sollen daher die CRISPR-Cas Systeme I-B und I-D in den Haloarchaeen Haloferax volcanii und Halorubrum lacusprofundi untersucht werden. In den Vorarbeiten haben wir die Inferenzreaktion des I-B Systems von H. volcanii eingehend charakterisiert, indem wir die Zusammensetzung des Effektorkomplex, die PAM Sequenzen und die Eigenschaften für eine funktionelle crRNA bestimmt haben. Auch haben wir erste Untersuchungen zu Adaptationsreaktionen und zum Typ I-D in H. lacusprofundi durchgeführt. Außerdem konnten wir Halorubrum erfolgreich mit Viren infizieren.Im Rahmen dieses Projektes wollen wir das Typ I-D System von H. lacusprofundi eingehend hinsichtlich der Zusammensetzung des Effektorkomplexes und der Voraussetzung für eine effektive Interferenz untersuchen (PAM Sequenzen, Parameter für eine aktive crRNA). H. lacusprofundi besitzt neben dem I-D System auch ein I-B System, und es sollen mögliche Krossreaktivitäten zwischen den beiden Systemen I-B und I-D analysiert werden. Außerdem sollen Anti-CRISPR Proteine für das I-B System identifiziert werden. Auch die Adaptationsreaktion soll studiert werden, sowohl in Haloferax als auch in Halorubrum. Für Haloferax haben wir Adaptation beim Self-Targeting beobachtet und diesen Schritt wollen wir eingehend analysieren. Für Halorubrum haben wir Viren gefunden, die wir zur Infektion benutzen werden, bei der wir dann auch die Adaptation studieren können. Zusätzlich werden wir die CRISPR-Cas assoziierten CARF Proteine untersuchen. Es gibt zwei CARF Proteine in Haloferax, deren Funktion nicht bekannt ist, und diese werden wir eingehend analysieren. Außerdem werden wir ein CRISPRa Werkzeug entwickeln, um die Expression von Genen in Haloferax gezielt zu aktivieren.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen