Mechanismus des HOPS-abhängigen Targeting von AP-3 Vesikeln zur Hefevakuole

• Antragsteller: Professor Dr. Christian Ungermann
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 422067766

Der AP-3-Weg transportiert mehrere Schlüsselproteine vom Golgi zur Vakuole, die deren Identität und Funktion als Zielorganell des endolysosomalen Weges bestimmen. Dazu gehören die Casein-Kinase Yck3 und die SNAREs Vam3 und Nyv1. Yck3 wiederum phosphoryliert mehrere an der Fusionskaskade beteiligte Proteine, vermutlich auf der Vakuole. Yck3 wird sowohl in Vesikeln als auch auf der Vakuole gefunden, und die Deletion beeinträchtigt den AP-3-Transport. Es bleibt hingegen völlig unklar, wo und wie die Funktion von Yck3 benötigt wird. Das Projekt zielt daher darauf ab, den molekularen Mechanismus zu verstehen, wie Yck3 den AP-3-Weg reguliert, und so die Organisation der zugrunde liegenden Maschinerie zu klären, die für die AP-3-Fusion mit der Vakuole (oder dem Endosom) erforderlich ist. In Aim 1 werden wir fragen, welcher spezifische Teil der Fusionsmaschinerie auf AP-3-Vesikeln benötigt wird. Dazu werden wir ein neuartiges Protokoll zur Reinigung nativer AP-3-Vesikel mit einem spezifisch modifizierten AP-3-Frachtprotein entwickeln und die AP-3-spezifische Fusionsmaschinerie mit Hilfe von Organellen-Reinigungsprotokollen und Massenspektrometrie bestimmen. In Aim 2 werden wir klären, auf welcher Organellenmembran Yck3 für einen effizienten AP-3-Transport zur Vakuole erforderlich ist und wie der AP-3-Transport reguliert wird. Wir werden eine Reihe von Yck3-Konstrukten entwerfen, die Yck3 an Endosomen oder der Vakuole einfangen. Dies wird klären, wo die Phosphorylierung der Zielproteine am ehesten erforderlich ist. In diesem Zusammenhang werden wir feststellen, wie die Phosphorylierung von Yck3 selbst (die meist am C-terminalen Teil stattfindet) dessen Funktion beeinflusst und welche Kinase dafür verantwortlich ist. In Aim 3 werden wir schließlich gereinigte AP-3-Vesikel und unser rekonstituiertes System verwenden, um die Fusion von AP-3-Vesikeln mit der Vakuole zu rekapitulieren. Basierend auf unseren Erkenntnissen aus Aim 1 und Aim 2 werden wir einen heterotypischen Fusionstest mit gereinigten Organellen oder rekonstituierten Proteoliposomen und Liposomen, die die Vakuole nachahmen, durchführen, um die Beteiligung der Fusionsmaschinen (SNAREs, HOPS, Ypt7) und Regulatoren (Mon1-Ccz1, Yck3) in diesem Test zu testen. Mögliche Mutanten in jedem Protein werden als Kontrolle verwendet. Die kombinierten Ansätze sollen klären, wie AP-3-Vesikel spezifisch auf die Vakuolenoberfläche gelenkt werden und deren Identität bestimmen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen