Molekulare Mechanismen der funktionell relevanten Ausbildung getrennter Phasen für die Biogenese von siRNAs durch Drosophila Loqs, Ago2 und dsRNA

• Antragsteller: Professor Dr. Klaus Förstemann; Professor Dr. Michael Sattler
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Biochemie und Physiologie der Tiere ; Strukturbiologie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 419138605

Negative Regulation durch kleine RNAs kontrolliert die Gen-Expression, dient aber auch der Abwehr von Pathogenen und parasitischen DNA Sequenzen. In Insekten liegt eine Spezialisierung der kleinen RNAs für diese Aufgaben vor; da RNA Interferenz hier ein sehr wichtiger Abwehrmechanismus ist, müssen die Biogenese-Wege gut voneinander „isoliert“ verlaufen, um eine schnelle und starke Antwort gegen das Pathogen zu bilden. Hier spielt die Phasentrennung eine wichtige Rolle, für miRNAs ist z.B. der P-body von Bedeutung, ein zytoplasmatisches Kondensat. Wir haben die induzierte Phasentrennung des dsRNA bindenden Proteins Loqs sowie der Glutamin-reichen, unstrukturierten Domäne des Effektors Ago2 mit doppelsträngiger RNA (dsRNA) untersucht. Die Ago2-Domäne bildet zusammen mit Nukleinsäuren eine eigene Phase aus; wenn dsRNA enthalten ist, kann das Loqs-Protein sich in dieser Phase anreichern, woran auch die Loqs N-terminale Domäne beteiligt ist. Biophysikalische Untersuchungen zeigen, dass dieses Phänomen reversibel ist, dass die kondensierten Proteine mobil bleiben und dass Loqs dafür in der Lage sein muss, dsRNA tatsächlich zu binden. NMR-spektroskopische Untersuchungen konnten beweisen, dass die Ago2-Domöne keine spezifische Faltung aufweist, dennoch konnten klare Veränderungen beim Phasenübergang gemessen werden. Im Gegensatz dazu kann die ebenfalls Glutamin-reiche N-terminale Domäne von Loqs mit der ersten dsRNA bindenden Domäne wechselwirken und diese vermutlich inhibieren; dies könnte ein regulatorischer Vorgang sein, der gleichzeitig die siRNA Biogenese und die Phasentrennung beeinflusst. Auch in Zellen konnten wir zeigen, dass GFP-Loqs einer Phasentrennung unterliegt, dass die Moleküle im Kondensat mobil bleiben und dass dsRNA Bindung an die zweite Domäne essentiell ist. Wir werden nun eine detaillierte spektroskopische und biophysikalische Analyse der beteiligten Protein-Domänen durchführen, um die zu Grunde liegenden molekularen Wechselwirkungen genau zu charakterisieren. Insbesondere werden wir die Interaktion der N-terminale Domäne von Loqs mit der ersten dsRNA bindenden Domäne ausmessen. Welche Aminosäuren sind essentielle Kontaktstellen? Wie verändert sich die Loqs-Struktur durch diese Auto-Regulation, was bedeutet das für die dsRNA Bindung und welche Konsequenzen hat das in vivo? Welche Faktoren interagieren ebenfalls mit dem dsRNA-abhängigen Kondensat? Wie wird ein spezifischer Flux von dsRNA und/oder siRNAs durch das Kondensat erreicht? Die Ergebnisse unserer biophysikalischen Messungen werden es uns ermöglichen, gezielte Protein-Mutationen zu setzen und die Konsequenzen in vitro und in Zellen zu untersuchen, so dass wir eine vollständige Beschreibung der Rolle dieser Phasentrennung auf die siRNA-Biogenese und die Pathogen-Abwehr erhalten.

• DFG-Verfahren: Schwerpunktprogramme
• Teilprojekt zu: SPP 2191: Molekulare Mechanismen funktioneller Phasenseparation