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Projekt
Mikrofluidische Analyse der Mehrfachphasentrennung in der Ubiquitin-vermittelten Proteostasis.
Antragsteller
Professor Dr. Michael Heymann
Fachliche Zuordnung
Biophysik
Zellbiologie
Zellbiologie
Förderung
Förderung von 2019 bis 2023
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 419138236
Dieses Projekt wird einen mikofludischen PhaseBildschirmChip entwickeln, um die enzymatische Aktivität und die Kompositionskontrolle des Tumorsuppressors SPOP mit dessen Substraten in flüssig phasengetrennten Organellen im Zell-nukleus zu analysieren.Verschiedene, durch Flüssig-Phasentrennung geformte, membranlose Organellen wurden in den letzten Jahren beschrieben. Viele Komponenten dieser Organellen wurden identifiziert und erfolgreich in vitro rekonstituiert. Die generellen Prinzipien welche die Zusammensetzung und Funktion der Organellen bestimmen, sind jedoch schwierig experimentell zu charakterisieren. Dieses ist im Besonderen für dynamische Aspekte der Fall, wie frühe und spätere Stadien oder Hysterese in der Phasentrennung, sowie molekulare Anordnungen und Reorganisaitonsdynamiken, aber auch die Quantifizierung enzymatischer Aktivitäten. Darüber hinaus, können unterschiedliche Arten phasengetrennter Organellen co-exisiteren, sich jedoch Enzyme sowie Substrate teilen. Wie wird beeinflusst die Verteilung zwischen den verschiedenen Organellen deren Funktion und wie ist dieser Prozess reguliert.Unser PhaseBildschirmChip beinhaltet tausende Femtoliter kleine Biopixel, von denen jeder eine Flüssig-Phasentrennungsreaktion mit definierter Zusammensetzung und Temperatur durchführen kann. Sowohl Temperatur also auch Rezeptur werden in jedem Biopixel nachjustierbar sein, wodurch sich Phasengrenzen, enzymatische Aktivitäten und andere dynamische Schritte akkurat kartieren lassen. Im Vergleich zu konventionellen Methoden, wird der PhaseBildschirmChip den Probenverbrauch um zwei bis drei Größenordnungen auf unter 10 Mikroliter Volumen pro Phasendiagram senken. Gleichzeitig wird die Anzahl gemessener Datenpunkte pro Phasendiagram (Pixelauflösung) um zwei bis drei Größenordnungen erhöht.Wir werden unseren PhaseBildschirmChip am Beispiel der Phasentrennung des Tumorsuppressors SPOP-Proteins mit dessen Substraten in flüssig phasengetrennten Organellen im Zellnukleus validieren. SPOP ist ein Substratadaptor für die Culling3-Ring Ubiquitin Ligase und lokalisiert in verschiedene substratangereicherte membranfreie Organellen im Nukleus, wo es diese Substrate ubiquitiniert. Unter Zuhilfenahme unseres PhaseBildschirmChips wollen wir Nichtgleichgewichtsaspekte sowie regulatorische Mechanismen welche die Partitionierung von SPOP und deren Substraten sowie deren Einfluss auf die Phasentrennung untersuchen. Dadurch erhoffen wir uns Einblicke, wie die substratvermittelte Phasentrennung SPOP sowie potentiell andere Ubiquitin Ligasen aktivieren kann um dadurch die Einstellung und Erhaltung der Ubiquitin vermittelten Proteostase besser zu verstehen. Dies wir es uns erlauben nach kleinen Wirkstoffmolekülen zu suchen, welche die Phasentrennungs-Artefakte welche in SPOP vermittelten Krebsmutanten vorherrschen zu kompensieren, um so einen neuen Krebsterapieansatz aufzuzeigen.
DFG-Verfahren
Schwerpunktprogramme
